人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的蛋白質(zhì)工程研究.pdf

1、肥胖已成為全球性的一種慢性流行病,肥胖及其并發(fā)癥已成為現(xiàn)代社會的沉重負擔.減肥藥物的研究與開發(fā)已成為各大制藥公司優(yōu)先考慮的一個重要目標.Leptin的發(fā)現(xiàn)揭示了體暈控制的分子機制.但由于大多數(shù)患者都對leptin耐受,使得leptin不能成為一個有效的治療肥胖癥的藥物.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一種天然的leptin的"模擬物",可通過其特異性受體激發(fā)與leptin相似的信號轉

2、導通路,從而有效地繞過leptin耐受.動物實驗和臨床研究都顯示了CNTF在治療肥胖癥上的良好的應用前景.Regeneron公司發(fā)明的hCNTF的三重突變體AX15已完成肥胖癥的Ⅲ期臨床實驗,并取得了統(tǒng)計學上具有顯著性差異的結果.但AX15分子的一些缺陷如易被蛋白酶降解,易聚合,較強的免疫原性和較短的半衰期等使其在成為藥物上遇到了障礙.該研究擬針對上述缺陷對AX15進行改造.通過N-端氨基酸測序確定了AX15在巴斯德畢赤酵母中表達時的降

3、解位點,并利用定點突變技術構建了蛋白酶抗性突變體AX15(R13K).AX15(R13K)的穩(wěn)定性得到了顯著的提高,在搖瓶中誘導120小時后也未發(fā)生降解.雖然能被有效的分泌,AX15(R13K)在上清中以分子量為數(shù)十萬以上的聚集體形式存在.6M鹽酸胍可使AX15(R13K)聚集體解聚,利用Superdex75凝膠過濾層析可同時完成蛋白的復性和純化.體外的TF-1存活實驗和體內(nèi)減肥實驗都表明AX15(R13K)具有與AX15相當?shù)纳飳W活

4、性.蛋白酶抗性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體可能具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性,在臨床應用上具有潛在的優(yōu)勢.利用家族性DNA改組技術構建了人-大鼠嵌合CNTF分子文庫.將AX15中Q63R突變及DH-CNTF中的S166D/Q167H突變組合在一起,構建了DH-AX15(R13K)突變體.體外和體內(nèi)實驗表明了DH-AX15(R13K)的活性約是AX15(R13K)的5倍.在人CNTF分子表面由第44位L,第83位F,第85位V,第86位L,第98位F,

5、第151位L,第152位F,第156位L,第157位W和第159位L組成一個主要疏水區(qū)域.為了用親水性的糖鏈覆蓋該區(qū)域,防止CNTF突變體由疏水作用引起的聚合,在AX15(R13K)的第36,39,40,152,159位引入了糖基化位點,構建了5個糖基化突變體.在5個突變體中N36-AX15(R13K),N40-AX15(R13K),N159-AX15(R13K)等未能得到表達,N152-AX15(R13K)雖然能表達但未發(fā)生糖基化,只