睫狀神經營養(yǎng)因子CNTF基因重組腺病毒的包裝.pdf

1、目的：周圍神經損傷是臨床上常見疾病，周圍神經損傷的顯微外科修復技術已經十分精湛，卻長期以來難以獲得滿意結果。隨著分子生物學和基因轉移技術不斷進步，神經損傷的基因治療研究正在興起。
　　 應用復制缺陷型重組腺病毒（Adenovirus，AdV）為載體將各種神經營養(yǎng)因子基因轉入脊髓以保護受損的神經元和促進周圍神經再生的研究，已成為神經修復研究領域的前沿課題。有關腺病毒的研究和開發(fā)進展很快，并已成功應用于多項基因治療臨床試驗中。腺病毒

2、載體具有感染效率高、宿主范圍廣、能感染分裂期或靜息期細胞、基因裝載容量大、易制備高滴度病毒、不插入宿主基因組、遺傳毒性較低等優(yōu)點。CNTF是由200個氨基酸組成的酸性蛋白，與NTF家族沒有同源性，被稱為非靶源性營養(yǎng)因子。
　　 CNTF在神經再生過程中起著重要的營養(yǎng)支持作用，其作用能支持感覺、交感及運動神經元存活和分化，防止軸突切斷后運動神經元的凋亡以及神經細胞在發(fā)育過程中的程序性死亡。它還是第一個被發(fā)現的能促進離體和在體運動神

3、經元存活，防止神經退變的神經因子。CNTF和其受體在神經系統中廣泛存在，具有廣泛的生物學活性，可以提高體內外各種類型外周神經元的存活。在周圍神經系統、髓鞘和睫狀神經節(jié)的雪旺氏細胞（SC），CNTF呈高水平表達，主要位于細胞體和突起，而核中無陽性反應。CNTF主要存在于星形膠質細胞；作用模式是逆向傳遞機制，睫狀神經營養(yǎng)因子（CNTF）的生物功能多樣，能促進運動神經元群細胞存活，對中樞神經系統及周圍神經系統神經細胞的生長、分化都具有明顯的營

4、養(yǎng)作用。利用分子生物技術克隆大鼠睫狀神經生長因子（CNTF）基因片段構建腺病毒載體，制備病毒顆粒從而進一步為研究腺病毒載體介導的睫狀神經營養(yǎng)因子在周圍神經損傷中的應用提供了基礎。
　　 方法：
　　 1.利用實驗室保存的普通感受態(tài)制作超級感受態(tài)。從感受態(tài)大腸桿菌菌種中抽吸菌液培養(yǎng)過夜轉接于200mlLB培養(yǎng)基中，在OD600值在0.4左右時收獲細菌。加入100ul預冷0.1M CaCL2溶液，冷凍離心用移液槍輕輕上下吸動

5、打勻，使細胞重新懸浮，動作輕柔。細胞懸浮液可立即用于轉化試驗或加入15％-30％的甘油后-80℃保存待用。（具體見實驗步驟）
　　 2.利用公司已經包裝的含有CNTF的腺病毒載體的質粒在超級感受態(tài)中轉化從而擴增得到能夠轉染計量的質粒。在感受態(tài)中加入質粒5ul冰上解凍，熱擊后冰上冷卻，加入培養(yǎng)基后震蕩培養(yǎng)1小時，在篩選平板上鋪板培養(yǎng)16-24小時，長出單克隆菌群后挑菌培養(yǎng)，離心后按質粒提取試劑盒步驟提取質粒。
　　 3.擴

6、增后得到的質粒使用脂質體2000轉染試劑盒轉染人腎胚293細胞，培養(yǎng)細胞，包裝帶有CNTF基因的重組腺病毒，在-70℃和37℃溫度下通過反復凍融制備高滴度腺病毒。
　　 4.病毒擴增后在96孔板中感染培養(yǎng)好的人腎胚293細胞，在顯微鏡下可觀察到293細胞有明顯的CPE現象，利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。
　　 結果：
　　 1.將擴增質粒按照實驗步驟的體系配好，制膠測定篩選擴增質粒與公司合成質粒酶切結

7、果相同。
　　 2.重組質粒轉染后的293細胞在培養(yǎng)24小時后即可在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞發(fā)出綠色熒光，即檢測到報告基因CNTF的表達，細胞表達出攜帶目的基因的腺病毒顆粒，對照組未發(fā)現熒光表達。轉染成功。
　　 3.在96孔板上培養(yǎng)293細胞，用獲得病毒感染293細胞后計數出現CPE孔個數，測定病毒滴度。最后獲得病毒滴度為2.5×107TCID50/ml。
　　 結論：
　　 1.利用可靠的方法成功的