糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定型人B7-1基因重組蛋白錨定自體腫瘤細(xì)胞膜對(duì)提高CTL殺傷泌尿系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的研究.pdf

1、　　本項(xiàng)研究依據(jù)腫瘤免疫過程中共刺激因子B7的作用，和GPI錨定信號(hào)的理論和方法，利用分子生物學(xué)手段，將B7胞外區(qū)編碼序列同天然GPI蛋白衰變加速因子(DAF)C端編碼34個(gè)氨基酸的錨定信號(hào)的基因序列重組，將重組基因插入真核表達(dá)載體pCDNA3，構(gòu)建表達(dá)載體pCDNA3-GPI-B7-1，與質(zhì)粒pSV2-dhfr共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR-細(xì)胞，經(jīng)G418篩選和MTX加壓，篩選出穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，目的蛋白GPI·B7-1分離純化后，

2、經(jīng)WesternBlot檢測活性。提純的目的蛋白錨定于小鼠前列腺癌細(xì)胞(RM-1)細(xì)胞膜上，免疫小鼠后，一組小鼠取脾細(xì)胞檢測CTL功能和T細(xì)胞擴(kuò)增情況，另一組小鼠進(jìn)行腫瘤接種實(shí)驗(yàn)，探討GPI·B7-1作為腫瘤疫苗的意義。并進(jìn)一步探討利用GPI錨定蛋白轉(zhuǎn)化法制備腫瘤疫苗在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的應(yīng)用前景。結(jié)果和結(jié)論如下：1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-GPI-B7-1和質(zhì)粒pSV2-dhfr共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR-細(xì)胞，經(jīng)G418篩

3、選和MTX加壓，獲得長久穩(wěn)定表達(dá)GPI·B7-1蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。而且因選用二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染的pSV2-dhfr質(zhì)粒帶動(dòng)目的蛋白大量表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和直接免疫熒光染色證實(shí)，而且目的蛋白GPI·B7-1可被糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PIPLC)特異性酶解，表明目的蛋白是以GPI蛋白形式表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面。2.分離提取的GPI·B7-1蛋白經(jīng)WesternBlot檢測具有免疫活性，并可錨定在C57B