胞內段氨基酸序列對corin在細胞膜錨定及活化的影響.pdf

1、目的：Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶(Type II Transmembrane Serine Protease,TTSP),通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細胞膜上。與許多絲氨酸蛋白酶一樣,corin以無活性酶原形式在核糖體中合成,經內質網(wǎng)、高爾基體,錨定在細胞膜上,從而發(fā)揮其生物學功能?，F(xiàn)有文獻報道,某些跨膜蛋白的胞內近膜區(qū)氨基酸序列在其細胞膜錨定與活化中起重要作用。Corin蛋白含有一個短的氨基端胞質尾部,有研究表明

2、人corin蛋白氨基端胞內段的“天冬氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺”(Asp-Asp-Asn-Asn,DDNN)基序,可以影響 corin蛋白在細胞膜的錨定和活化。但是,小鼠 corin胞內段不含有DDNN基序,長短也不同于人corin。因此,我們推斷小鼠corin胞內段可能存在其它的影響corin在細胞膜錨定與活化的序列。目前尚未有相關研究報道。本文從胞內段近膜區(qū)的氨基酸序列和跨膜區(qū)胞內側的電荷兩方面,在國內外率先開展工作,研究胞

3、內段結構對小鼠corin在細胞膜的錨定與活化的影響,從而闡明corin的結構與功能的關系,揭示II型跨膜絲氨酸蛋白酶在細胞膜錨定的機制。
　　方法：⑴以小鼠野生型corin質粒mE1a為模板,用Vector NTI軟件設計引物,利用PCR定點突變技術(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit)構建一系列胞內段截短型corin表達載體及其它corin突變體。⑵將野生型及突變

4、corin質粒轉染人胚腎(human embryonic kidney,HEK)293細胞,制備細胞裂解液,蛋白質免疫印跡法(Western blotting)檢測重組corin蛋白在細胞漿內的表達及活化情況。⑶利用生物素標記細胞膜蛋白和流式細胞術檢測截短型/突變體 corin在細胞膜表面的表達情況。⑷將野生和突變corin表達質粒轉染到pro-ANP穩(wěn)定表達的HEK293細胞中,Western blotting檢測上清中的pro-AN

5、P和ANP,評估基因突變對corin功能的影響。
　　結果：①分別去掉胞內段50和99個氨基酸殘基,構建小鼠截短型corin mD50和mD99表達載體。轉染HEK293細胞,Western blotting檢測細胞裂解液中corin的表達與活化,與野生型corin mE1a相比,mD50對corin蛋白的表達和活化都沒有影響,mD99對corin蛋白表達沒有影響,但是,mD99 corin蛋白的活化量顯著增加(29.00±0.3

6、2％vs.12.48±1.89％,p=0.0001,n=4)。我們還分別用生物素標記細胞表面蛋白和流式細胞術檢測corin在細胞膜的表達,發(fā)現(xiàn)mD99在細胞膜上的表達量顯著增加。結果提示:氨基端胞內段第50到第99個氨基酸之間存在抑制小鼠corin蛋白在細胞表面表達和活化的序列。②分別去掉胞內段60、70和75個氨基酸,構建表達載體mD60、mD70和mD75。轉染HEK293細胞,Western blotting檢測corin的表達與

7、活化,發(fā)現(xiàn)這些突變不影響corin在細胞內的表達,但與野生型corin mE1a相比,mD75的活化顯著增加(28.73±0.01％vs.16.63±0.04％,p=0.02,n=3)。流式細胞術檢測也發(fā)現(xiàn)轉染mD75的HEK293細胞表面corin陽性率明顯高于野生型corin mE1a(76.34±4.43％vs.40.04±5.10％,p=0.0017,n=4)。據(jù)此,我們推測抑制序列位于第70到第75個氨基酸之間。③從胞內段依次

8、去掉71、72、73和74個氨基酸,構建表達載體mD71、mD72、mD73和mD74。轉染HEK293細胞,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),與野生型 corin mE1a相比,突變體在細胞內的表達未受影響,但 mD72、mD73和mD74corin蛋白的活化量顯著增加。推斷:氨基端胞內段第72位的苯丙氨酸可能對小鼠corin蛋白在細胞膜錨定活化起重要作用。以mE1a為模板,分別將71位賴氨酸(Lys,K)、72位苯丙氨酸(P

9、he,F)和73位的谷氨酰胺(Gln,Q)突變成丙氨酸(Ala,A),即K71A、F72A和Q73A,并構建表達載體K71A/F72A/Q73A。質粒轉染HEK293細胞,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)突變體 K71A、F72A和 Q73A對corin的表達和活化都沒有影響,而K71A/F72A/Q73A不影響corin的表達,但與野生型corin mE1a相比,活化量顯著增加(28.69±1.29％vs.19.58±1.42

10、％,p=0.009,n=3)。提示氨基端胞內段第71、72和73位的KFQ基序可以抑制小鼠corin蛋白在細胞膜上的表達和活化。④為研究小鼠corin蛋白錨定到細胞膜上最少需要幾個氨基酸殘基,我們以mE1a為模板,從小鼠corin的胞內段依次去除106、111和112個氨基酸殘基,構建mD106、mD111和mD112。轉染HEK293細胞,研究發(fā)現(xiàn)這些突變不影響corin在細胞內的表達,但corin mD112不能被活化;流式細胞術檢

11、測也發(fā)現(xiàn)突變體mD112幾乎不在膜上表達;Western blotting檢測corin的功能,也發(fā)現(xiàn)mD112不能將pro-ANP活化為ANP,即不具有生物學功能。說明小鼠corin蛋白氨基端胞內段起始氨基酸甲硫氨酸(methionine,Met)和膜內側的精氨酸對corin在細胞膜錨定非常重要。⑤研究了胞內側氨基酸的電荷對小鼠corin蛋白在細胞膜上的錨定和活化的影響。以mD111為模板,把胞內段第112位精氨酸(Arg,R)突變成

12、丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)和賴氨酸(Lys,K)分別得到突變體D-R112A、D-R112D和D-R112K。轉染HEK293細胞,發(fā)現(xiàn)突變對corin在細胞內的表達沒有影響。但是D-R112A和D-R112D corin蛋白不能被活化,而精氨酸變成同樣帶正電荷的賴氨酸之后,D-R112K corin蛋白可以正常被活化。流式細胞術檢測也發(fā)現(xiàn)只有胞內段氨基酸帶正電荷時,corin蛋白才能在膜上表達并具有生物學功能。從而推

13、測, corin蛋白在胞內段除起始甲硫氨酸外,只需要一個帶正電荷的氨基酸就可以錨定到細胞膜上。為了進一步驗證我們的結論,我們以mE1a為模板,分別把112位精氨酸(Arg, R)突變成丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)、谷氨酸(Glu,E)、賴氨酸(Lys, K)和組氨酸(His,H),得到突變體 R112A、R112D、R112E、R112K和 R112H。質粒轉染HEK293細胞,Western blotting和流式細胞

14、術檢測都證實當112位是正電荷氨基酸時,corin蛋白可以在細胞膜上錨定和活化,變成帶負電荷或者中性氨基酸時, corin蛋白就不能錨定到細胞膜上。
　　結論：⑴KFQ基序是小鼠corin蛋白胞內段存在的一個抑制corin向細胞膜轉運及活化的信號。⑵小鼠corin蛋白僅需要一個位于胞內段112位精氨酸就可以錨定到質膜上被活化成為有功能的蛋白。⑶近膜區(qū)的正電荷是小鼠corin蛋白在細胞膜錨定所必需的,且正電性越強越利于蛋白在細胞膜上