組織因子基因沉默對(duì)胎盤(pán)早剝HUVECs的影響.pdf

1、背景和目的： 胎盤(pán)早剝(placelltal abruption，PA)是妊娠晚期嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒死亡的最主要的原因之一，胎盤(pán)早剝?cè)黾恿诵律鷥旱陌l(fā)病率和死亡率，也被證實(shí)是出生低體重如小于胎齡兒的發(fā)生原因之一，國(guó)內(nèi)楊建波等報(bào)道發(fā)病率為0.06％～2.1％，這部分新生兒中死亡率較高，高達(dá)20％～35％，15倍于無(wú)胎盤(pán)早剝者，蘇丹的wad Medani醫(yī)院報(bào)道的PA的發(fā)病率占正常分娩的6.5％，其中死胎和出生后一個(gè)月的死亡率

2、為20.2％，Salihu報(bào)道美國(guó)1995-1998年出生的1548.8萬(wàn)嬰兒中單胎、雙胎及三胞胎胎盤(pán)早剝的發(fā)生率不一致，各為6.2/1000、12.2/1000及15.6/1000，隨著胎兒數(shù)量的增加，胎盤(pán)早剝的發(fā)生率增加。胎盤(pán)早剝母親分娩的新生兒中，大多數(shù)會(huì)發(fā)生凝血功能障礙，而在嚴(yán)重的胎盤(pán)早剝以及其他嚴(yán)重的妊娠合并癥中，高凝狀態(tài)可以導(dǎo)致胎盤(pán)血栓形成，影響胎兒的凝血功能和生命安全，同樣是該類新生兒較為潛伏而兇險(xiǎn)的病理變化。 體

3、內(nèi)的凝血過(guò)程由外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑構(gòu)成，目前研究發(fā)現(xiàn)外源性凝血途徑在病理性凝血的過(guò)程中發(fā)揮著主要的作用，而組織因子作為外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，與許多疾病包括胎盤(pán)早剝對(duì)新生兒凝血系統(tǒng)的影響方面有著密切相關(guān)。 母親羊水、胎盤(pán)、蛻膜及子宮肌層中含有明顯高于血漿的組織因子，在分娩前的正常情況下，蛋白質(zhì)、多肽能夠通過(guò)出、入胞方式通過(guò)胎盤(pán)屏障，是由胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的特殊受體決定，部分物質(zhì)如激素類的蛋白質(zhì)跨越母親的胎盤(pán)屏障細(xì)

4、胞間隙時(shí)，受到胎盤(pán)屏障上的酶類存在下被降解而不會(huì)產(chǎn)生生理效應(yīng)，包括肽酶a酶類，來(lái)自母體的物質(zhì)在通過(guò)胎盤(pán)屏障的機(jī)制方面，目前認(rèn)為與母體面的血竇細(xì)胞滋養(yǎng)層及胎兒部分叢密的絨毛有關(guān)，胎盤(pán)可以選擇性地允許某些大分子物質(zhì)如IgG通過(guò)。胎盤(pán)早剝主要的病理改變是子宮的螺旋動(dòng)脈斷裂，其他的臨近組織也同時(shí)受到損傷，Kuczynski報(bào)道在PA的胎盤(pán)和子宮肌層中含有顯著高于血漿的TF，而TFPI的水平似乎很低，胎盤(pán)早剝發(fā)生時(shí)，其剝離處胎盤(pán)絨毛和蛻膜釋放大量

5、的組織因子，一方面這些凝血因子可能通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，影響胎兒及出生后的新生兒的凝血系統(tǒng)功能，另一方面由于損傷可能使胎兒體內(nèi)凝血系統(tǒng)受到激活，使胎兒以及產(chǎn)出后的新生兒發(fā)生凝血功能障礙，嚴(yán)重時(shí)由于凝血酶的增加，使大量纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白，最后產(chǎn)生廣泛性血管內(nèi)凝血。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，由于母親PA所入院的新生兒中，一部分患兒是處于高凝狀態(tài)，而重癥產(chǎn)婦所生新生兒多數(shù)在入院時(shí)已處于低凝期或者纖溶期。母體由于調(diào)節(jié)機(jī)制較為完善，需要較多的

6、促凝物質(zhì)進(jìn)入血循環(huán)才可引起嚴(yán)重的DIC，而胎兒機(jī)體小且調(diào)節(jié)機(jī)制不完善，只需要少量促凝物質(zhì)即可引起嚴(yán)重DIC。對(duì)這些情況如果處理不及時(shí)，就會(huì)危及胎兒及新生兒的生命，造成死胎或者新生兒DIC。我們研究在PA時(shí)凝血因子組織因子和抗凝物質(zhì)組織因子途徑抑制物在母親、臍血及新生兒血液中的變化，從而也了解在胎盤(pán)損傷時(shí)其兩側(cè)的這兩種蛋白質(zhì)分子是否存在差異，目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)報(bào)道。盡管在新生兒的這種高危狀態(tài)下治療是多方面的，但目前的治療主要在被動(dòng)地

7、應(yīng)用纖維蛋白原、血小板及其他凝血因子。在治療這類出凝血性疾病時(shí)，設(shè)想通過(guò)瞬時(shí)關(guān)閉組織因子途徑中組織因子的表達(dá)，達(dá)到短暫阻止凝血過(guò)程的啟動(dòng)，減少凝血因子和血小板的消耗，從而防治母親胎盤(pán)早剝對(duì)新生兒凝血功能的影響。 RNAi技術(shù)(RNA interference，RNAi)是一種可高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)并在基因功能研究和基因治療領(lǐng)域有著廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。近年來(lái)進(jìn)展主要集中在誘導(dǎo)特異性靶基因表達(dá)沉默、干擾信號(hào)傳導(dǎo)通路、抑制艾

8、滋病病毒基因和肝炎病毒基因、抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過(guò)度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望成為這類疾病新的手段。我們?cè)O(shè)想應(yīng)用RNAi技術(shù)瞬時(shí)關(guān)閉組織因子的表達(dá)，達(dá)到阻止凝血過(guò)程的啟動(dòng)，干擾病理性的凝血過(guò)程，從而減少胎盤(pán)早剝對(duì)新生兒凝血功能的影響，具有一定的臨床實(shí)用意義。而臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical vein Endothelial Cell，HUVECs)由于便利和來(lái)源豐富在疾病研究方面存在很大

9、的優(yōu)勢(shì)，主要集中在為出凝血疾病、組織學(xué)工程人工血管、動(dòng)脈粥樣硬化等方面的研究提供很好工具。 我們?cè)谠囵B(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，建立組織因子基因干擾載體系統(tǒng)，利用近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RNAi技術(shù)，分別對(duì)胎盤(pán)早剝和正常出生的新生兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的組織因子表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，將構(gòu)建的組織因子干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，沉默內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)，為進(jìn)一步的基因治療打下基礎(chǔ)。 結(jié)論 l、PA產(chǎn)婦、臍血及新生兒血中TF較正

10、常者升高，TFFI降低，TFPI/TF降低，PA時(shí)產(chǎn)婦和新生兒促凝血功能增強(qiáng)，抗凝血活性降低，與其高凝狀態(tài)相關(guān)。 2、從正常對(duì)照組和胎盤(pán)早剝實(shí)驗(yàn)組胎兒的臍靜脈能夠大量成功地培養(yǎng)出HUVECs，通過(guò)形態(tài)學(xué)和免疫熒光檢測(cè)證實(shí)為HLJVECs，為實(shí)驗(yàn)提供良好的研究工具。 3、成功構(gòu)建的pENTR<'TM>/U6-TF-shRNA測(cè)序結(jié)果正確，并能夠轉(zhuǎn)染到HUVECs，發(fā)揮其生物學(xué)功能，干擾TF的表達(dá)。 4、在胎盤(pán)早剝組

11、的HUVECs中TF mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，可能是胎盤(pán)早剝產(chǎn)婦及新生兒高凝狀態(tài)的原因之一。 5、pENTR<'TM>/U6-TF-shRNA能夠顯著抑制正常分娩和胎盤(pán)早剝產(chǎn)婦胎兒臍帶的HUVECs中TF的表達(dá)，可能成為未來(lái)生物學(xué)治療的新的手段。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1、首次在國(guó)內(nèi)研究PA時(shí)TF及TFPI在母親、臍血及新生兒血中的變化。 2、應(yīng)用pENTR<'TM>/U6載體系統(tǒng)構(gòu)建pENTRTM/U6-T