組織因子基因沉默對胎盤早剝HUVECs的影響.pdf

1、背景和目的： 胎盤早剝(placelltal abruption，PA)是妊娠晚期嚴重并發(fā)癥，也是導致圍產(chǎn)兒死亡的最主要的原因之一，胎盤早剝增加了新生兒的發(fā)病率和死亡率，也被證實是出生低體重如小于胎齡兒的發(fā)生原因之一，國內(nèi)楊建波等報道發(fā)病率為0.06％～2.1％，這部分新生兒中死亡率較高，高達20％～35％，15倍于無胎盤早剝者，蘇丹的wad Medani醫(yī)院報道的PA的發(fā)病率占正常分娩的6.5％，其中死胎和出生后一個月的死亡率

2、為20.2％，Salihu報道美國1995-1998年出生的1548.8萬嬰兒中單胎、雙胎及三胞胎胎盤早剝的發(fā)生率不一致，各為6.2/1000、12.2/1000及15.6/1000，隨著胎兒數(shù)量的增加，胎盤早剝的發(fā)生率增加。胎盤早剝母親分娩的新生兒中，大多數(shù)會發(fā)生凝血功能障礙，而在嚴重的胎盤早剝以及其他嚴重的妊娠合并癥中，高凝狀態(tài)可以導致胎盤血栓形成，影響胎兒的凝血功能和生命安全，同樣是該類新生兒較為潛伏而兇險的病理變化。 體

3、內(nèi)的凝血過程由外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑構成，目前研究發(fā)現(xiàn)外源性凝血途徑在病理性凝血的過程中發(fā)揮著主要的作用，而組織因子作為外源性凝血途徑的啟動因子，與許多疾病包括胎盤早剝對新生兒凝血系統(tǒng)的影響方面有著密切相關。 母親羊水、胎盤、蛻膜及子宮肌層中含有明顯高于血漿的組織因子，在分娩前的正常情況下，蛋白質(zhì)、多肽能夠通過出、入胞方式通過胎盤屏障，是由胎盤合體滋養(yǎng)層細胞表面的特殊受體決定，部分物質(zhì)如激素類的蛋白質(zhì)跨越母親的胎盤屏障細

4、胞間隙時，受到胎盤屏障上的酶類存在下被降解而不會產(chǎn)生生理效應，包括肽酶a酶類，來自母體的物質(zhì)在通過胎盤屏障的機制方面，目前認為與母體面的血竇細胞滋養(yǎng)層及胎兒部分叢密的絨毛有關，胎盤可以選擇性地允許某些大分子物質(zhì)如IgG通過。胎盤早剝主要的病理改變是子宮的螺旋動脈斷裂，其他的臨近組織也同時受到損傷，Kuczynski報道在PA的胎盤和子宮肌層中含有顯著高于血漿的TF，而TFPI的水平似乎很低，胎盤早剝發(fā)生時，其剝離處胎盤絨毛和蛻膜釋放大量

5、的組織因子，一方面這些凝血因子可能通過胎盤進入胎兒血液循環(huán)，影響胎兒及出生后的新生兒的凝血系統(tǒng)功能，另一方面由于損傷可能使胎兒體內(nèi)凝血系統(tǒng)受到激活，使胎兒以及產(chǎn)出后的新生兒發(fā)生凝血功能障礙，嚴重時由于凝血酶的增加，使大量纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白，最后產(chǎn)生廣泛性血管內(nèi)凝血。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，由于母親PA所入院的新生兒中，一部分患兒是處于高凝狀態(tài)，而重癥產(chǎn)婦所生新生兒多數(shù)在入院時已處于低凝期或者纖溶期。母體由于調(diào)節(jié)機制較為完善，需要較多的

6、促凝物質(zhì)進入血循環(huán)才可引起嚴重的DIC，而胎兒機體小且調(diào)節(jié)機制不完善，只需要少量促凝物質(zhì)即可引起嚴重DIC。對這些情況如果處理不及時，就會危及胎兒及新生兒的生命，造成死胎或者新生兒DIC。我們研究在PA時凝血因子組織因子和抗凝物質(zhì)組織因子途徑抑制物在母親、臍血及新生兒血液中的變化，從而也了解在胎盤損傷時其兩側(cè)的這兩種蛋白質(zhì)分子是否存在差異，目前在國內(nèi)外文獻中尚未見報道。盡管在新生兒的這種高危狀態(tài)下治療是多方面的，但目前的治療主要在被動地

7、應用纖維蛋白原、血小板及其他凝血因子。在治療這類出凝血性疾病時，設想通過瞬時關閉組織因子途徑中組織因子的表達，達到短暫阻止凝血過程的啟動，減少凝血因子和血小板的消耗，從而防治母親胎盤早剝對新生兒凝血功能的影響。 RNAi技術(RNA interference，RNAi)是一種可高效、特異地下調(diào)目標基因的表達并在基因功能研究和基因治療領域有著廣闊應用前景的技術。近年來進展主要集中在誘導特異性靶基因表達沉默、干擾信號傳導通路、抑制艾

8、滋病病毒基因和肝炎病毒基因、抑制癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望成為這類疾病新的手段。我們設想應用RNAi技術瞬時關閉組織因子的表達，達到阻止凝血過程的啟動，干擾病理性的凝血過程，從而減少胎盤早剝對新生兒凝血功能的影響，具有一定的臨床實用意義。而臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical vein Endothelial Cell，HUVECs)由于便利和來源豐富在疾病研究方面存在很大

9、的優(yōu)勢，主要集中在為出凝血疾病、組織學工程人工血管、動脈粥樣硬化等方面的研究提供很好工具。 我們在原代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞的基礎上，建立組織因子基因干擾載體系統(tǒng)，利用近年來發(fā)展起來的RNAi技術，分別對胎盤早剝和正常出生的新生兒臍靜脈內(nèi)皮細胞的組織因子表達進行干預，將構建的組織因子干擾載體轉(zhuǎn)染進入臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，沉默內(nèi)皮細胞組織因子表達，為進一步的基因治療打下基礎。 結(jié)論 l、PA產(chǎn)婦、臍血及新生兒血中TF較正

10、常者升高，TFFI降低，TFPI/TF降低，PA時產(chǎn)婦和新生兒促凝血功能增強，抗凝血活性降低，與其高凝狀態(tài)相關。 2、從正常對照組和胎盤早剝實驗組胎兒的臍靜脈能夠大量成功地培養(yǎng)出HUVECs，通過形態(tài)學和免疫熒光檢測證實為HLJVECs，為實驗提供良好的研究工具。 3、成功構建的pENTR<'TM>/U6-TF-shRNA測序結(jié)果正確，并能夠轉(zhuǎn)染到HUVECs，發(fā)揮其生物學功能，干擾TF的表達。 4、在胎盤早剝組

11、的HUVECs中TF mRNA表達高于正常對照組，可能是胎盤早剝產(chǎn)婦及新生兒高凝狀態(tài)的原因之一。 5、pENTR<'TM>/U6-TF-shRNA能夠顯著抑制正常分娩和胎盤早剝產(chǎn)婦胎兒臍帶的HUVECs中TF的表達，可能成為未來生物學治療的新的手段。 主要創(chuàng)新點： 1、首次在國內(nèi)研究PA時TF及TFPI在母親、臍血及新生兒血中的變化。 2、應用pENTR<'TM>/U6載體系統(tǒng)構建pENTRTM/U6-T