酸性鞘磷脂酶在二氧化硅致肺纖維化體外模型中的作用.pdf

1、目的：觀察酸性鞘磷脂酶(ASM)在二氧化硅(SiO2)致小鼠胚肺成纖維細(xì)胞(NIH3T3)纖維化過程中的變化及規(guī)律，探討ASM在SiO2致肺纖維化體外模型中的作用。
　　方法：ACP染色法檢測(cè)小鼠原代巨噬細(xì)胞(PAM)細(xì)胞純度;雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)測(cè)定PAM和小鼠胚胎巨噬細(xì)胞(RAW.264.7)的吞噬功能;收集SiO2刺激RAW.264.7和PAM細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法測(cè)定其IL-8、TNF-α及TGF-β1的分泌情況;SiO2

2、采用三種方式對(duì)NIH3T3進(jìn)行染毒:(1)SiO2直接刺激組，200 mg/LSiO2粉塵直接刺激NIH3T3(2) SiO2間接刺激組，收集200mg/LSiO2粉塵刺激PAM12h的培養(yǎng)上清再刺激NIH3T3(3) ASM抑制劑組，在間接刺激組的基礎(chǔ)上加入ASM抑制劑。按上述三種刺激方式6，12，18，24，36和48 h后收集細(xì)胞樣品。高效液相色譜法測(cè)定NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的ASM活性;消化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)羥脯氨酸(HYP)含量;Van

3、 Gieson膠原纖維染色法對(duì)NIH3T3細(xì)胞內(nèi)膠原纖維進(jìn)行染色;Western印跡法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膠原Ⅲ的表達(dá)。
　　結(jié)果：PAM細(xì)胞吞噬功能及分泌白細(xì)胞介素8(IL-8)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)活性較RAW.264.7高;SiO2刺激PAM12h，培養(yǎng)上清中IL-8、TGF-β1及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌中明顯增加(P＜0.01);直接刺激組中，NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ASM活性在36h明顯增加而其他時(shí)間點(diǎn)無變化，

4、HYP含量在48 h明顯增加而其他時(shí)間點(diǎn)無變化，膠原染色在36 h及48 h可見紅染的膠原纖維但其他時(shí)間點(diǎn)無變化，膠原Ⅲ表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化均不明顯;間接刺激組中，隨著PAM上清作用時(shí)間延長(zhǎng)，NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ASM活性、HYP含量、膠原Ⅲ表達(dá)均呈升高的趨勢(shì)，膠原纖維染色隨著PAM上清作用時(shí)間延長(zhǎng)紅染的膠原纖維也越多。ASM抑制劑組中，隨著PAM上清作用時(shí)間延長(zhǎng)，NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ASM活性、HYP含量、膠原Ⅲ表達(dá)均降低，膠原纖維染