莪術(shù)潰堅(jiān)方對(duì)胰腺癌抑瘤作用及其機(jī)理研究.pdf

1、第一部分DcR3在人胰腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)間關(guān)系
　　目的：研究胰腺癌中DcR3的蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)間關(guān)系。
　　方法：通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)人胰腺癌組織芯片中DcR3蛋白的表達(dá)，91例胰腺癌組織，5例正常胰腺組織，比較其表達(dá)差異，并在胰腺癌癌組織中分析其表達(dá)與主要臨床參數(shù)相關(guān)性。
　　結(jié)果： DcR3蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要分布于胞漿中，在胰腺癌中DcR3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織，且DcR3陽(yáng)

2、性表達(dá)與腫瘤TNN分期相關(guān)。分期越晚，其表達(dá)越高。
　　結(jié)論:胰腺癌組織中存在DcR3基因的過(guò)表達(dá)，DcR3的表達(dá)與腫瘤TNM分期相關(guān)。
　　第二部分莪術(shù)潰堅(jiān)方對(duì)胰腺癌MiaPaCa-2裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究
　　目的：在動(dòng)物體內(nèi)觀察莪術(shù)潰堅(jiān)方對(duì)人胰腺癌的抑瘤作用，為莪術(shù)潰堅(jiān)方應(yīng)用于臨床治療胰腺癌，改善預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：利用Real time PCR篩選出高表達(dá)DcR3的胰腺癌細(xì)胞系MiaPa

3、Ca-2，建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤，分成模型組、卡培他濱組、莪術(shù)潰堅(jiān)方低劑量組(10g/Kg)和莪術(shù)潰堅(jiān)方高劑量組(20g/Kg)干預(yù)治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，比較不同組間抑瘤率，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)不同組裸鼠腫瘤的DcR3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：DcR3在四種人胰腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中AsPC-1、MiaPaca-2和BxPC3細(xì)胞中DcR3表達(dá)量是PANC-1細(xì)胞的0.8，8.5和3.2倍;成功建立了MiaP

4、aCa-2胰腺癌荷瘤裸鼠模型，與模型組相比，卡培他濱組、莪術(shù)潰堅(jiān)方低劑量組(10g/Kg)及莪術(shù)潰堅(jiān)方高劑量(20g/Kg)對(duì)MiaPaCa-2體內(nèi)生長(zhǎng)有一定抑制作用，卡培他濱組、莪術(shù)潰堅(jiān)方低劑量組(10g/Kg)及莪術(shù)潰堅(jiān)方高劑量(20g/Kg)的腫瘤體積在造模后第3周、第4周時(shí)明顯小于模型組（P＜0.05）?？ㄅ嗨麨I組、莪術(shù)潰堅(jiān)方低劑量組(10g/Kg)及莪術(shù)潰堅(jiān)方高劑量(20g/Kg)的腫瘤體積在造模后第1-4周無(wú)明顯差別（P＞0

5、.05）;與模型組相比，卡培他濱組的DcR3蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），莪術(shù)潰堅(jiān)方低劑量組組(10g/Kg)及莪術(shù)潰堅(jiān)方高劑量組(20g/Kg)均明顯低于模型組（P＜0.05)。
　　結(jié)論：莪術(shù)潰堅(jiān)方可以通過(guò)抑制移植瘤內(nèi)的DcR3的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，達(dá)到治療作用。低劑量莪術(shù)潰堅(jiān)方和高劑量莪術(shù)潰堅(jiān)方抑瘤率無(wú)明顯差別。
　　第三部分莪術(shù)潰堅(jiān)方下調(diào)DcR3抑制人胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)
　　目的:研究莪術(shù)潰堅(jiān)方對(duì)人胰

6、腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲和凋亡影響和可能機(jī)制。
　　方法：通過(guò)MTT法檢測(cè)莪術(shù)潰堅(jiān)方單藥中主要單體莪術(shù)醇、呋喃二烯、吉馬酮、苦杏仁苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對(duì)Miapaca-2、BxPC-3對(duì)人胰腺癌細(xì)胞體外增殖影響，并繪制細(xì)胞增殖曲線;選取抑制腫瘤細(xì)胞最明顯的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)其對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞侵襲、凋亡的影響;體外設(shè)計(jì)針對(duì)DcR3基因的

7、siRNA1、siRNA2、siRNA3和contol siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將siRNA導(dǎo)入人胰腺癌細(xì)胞系miapaca-2，通過(guò)Western blot方法對(duì)細(xì)胞RNAi后DcR3表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，測(cè)定經(jīng)DcR3的RNAi后，柴胡皂苷a和d對(duì)凋亡敏感性影響。Western blot檢測(cè)檢測(cè)加入柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、U0126（ERK1/2抑制劑）后DcR3表達(dá)，以及MAPK信號(hào)通路下游反應(yīng)性靶基因ERK1/2及p-ERK1

8、/2。
　　結(jié)果：莪術(shù)潰堅(jiān)方中單體莪術(shù)醇、呋喃二烯、吉馬酮、苦杏仁苷對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaca-2和BxPC3有生長(zhǎng)抑制作用不明顯;柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaca-2和BxPC3有明顯生長(zhǎng)抑制作用(P＜0.05)，其抗腫瘤作用呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性，用藥72h后效應(yīng)明顯;在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用24h后，MiaPaCa-2細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力都明顯減弱。與未做任何處理的MiaPaCa-2細(xì)胞相比，經(jīng)柴胡皂苷a

9、作用24h后，傷口面積降低了61.2％(P＜0.05);經(jīng)柴胡皂苷d作用24h后，傷口面積降低了47.3％(P＜0.05)。在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用48h后，MiaPaCa-2細(xì)胞體外侵襲能力明顯減弱，經(jīng)柴胡皂苷a作用48小時(shí)后，侵襲細(xì)胞減少了26.5(P＜0.05);經(jīng)柴胡皂苷d作用48小時(shí)后，侵襲細(xì)胞數(shù)減少了31.2％(P＜0.05)。柴胡皂苷a體外給藥24h，可導(dǎo)致MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞凋亡顯著增加;柴胡皂苷d體外給藥2

10、4h，可導(dǎo)致MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞凋亡顯著增加;經(jīng)DcR3 RNAi后，可明顯增加對(duì)柴胡皂苷a、柴胡皂苷a對(duì)誘導(dǎo)MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞凋亡能力。經(jīng)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d和U0126（20um）作用48小時(shí)后，MiaPaCa-2細(xì)胞DcR3蛋白表達(dá)水平明顯降低，ERK1/2蛋白無(wú)明顯變化，p-ERK1/2表達(dá)隨之降低。
　　結(jié)論:莪術(shù)潰堅(jiān)方中柴胡皂苷a、d對(duì)胰腺腫瘤抑瘤效果明顯，且隨時(shí)間、劑量關(guān)系成正比，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明了