大黃素抗胰腺癌作用及機制研究.pdf

1、胰腺癌是胰腺的外分泌腺癌，為臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。胰腺癌發(fā)病率約占全部惡性腫瘤的1％～7％，但是近年來在全球范圍內，其發(fā)病率呈明顯增加趨勢。本文對大黃素抗胰腺癌的作用及其機制進行了研究，將為大黃素聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌的臨床應用提供客觀而科學的理論基礎和實驗依據(jù)，并為胰腺癌的臨床治療提供一種新的有效藥物。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：大黃素對人胰腺癌細胞株SW1990的生物學效應及其作用機制。
　　 目的

2、：⑴觀察大黃素對人胰腺癌細胞株SW1990的生物學效應；⑵探討大黃素誘導人胰腺癌SW1990凋亡的作用機制。
　　 方法：①在體外，將人胰腺癌SW1990細胞暴露于不同濃度的大黃素(10μM、20μM、40μM、80μM)中，觀察大黃素對人胰腺癌SW1990細胞形態(tài)學的影響，以CCK-8法檢測大黃素、及大黃素聯(lián)合吉西他濱對SW1990細胞增殖的影響，以流式細胞術觀察大黃素、及大黃素聯(lián)合吉西他濱對SW1990細胞凋亡的影響；②在體

3、外，以EMSA法檢測大黃素、吉西他濱分別單獨及聯(lián)合作用SW1990細胞48小時后NF-κB轉錄活性表達的影響，并以Western Blot法檢測SW1990細胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Survivin、Pro-Caspase3、8、9的變化情況，以進一步明確大黃素誘導人胰腺癌SW1990細胞凋亡的作用機制。
　　 結果：⑴在體外，大黃素能顯著抑制人胰腺癌細胞增殖，不同濃度大黃素(10μM、20μM、40μM、80μM)作用

4、SW1990細胞24 h后細胞存活率分別為85％、80％、65％和56％，呈明顯濃度依賴性(*P<0.05)；40μM大黃素處理12 h、24 h、48 h和72 h后，SW1990細胞存活率分別為88％、67％、47％和35％，呈時間依賴性(*P<0.05)；大黃素(40μM)聯(lián)合吉西他濱(20μM)作用72 h后細胞存活率僅為22.62％，相對吉西他濱組(30.78％)有顯著差異(*P<0.05)；大黃素作用后的SW1990細胞呈現(xiàn)

5、細胞凋亡的典型表現(xiàn)，Annexin V聯(lián)合PI法染色結果進一步明確了大黃素的促凋亡作用，且該作用具有藥物劑量依賴性；⑵大黃素(40μM)、吉西他濱(20μM)分別單獨或聯(lián)合用藥作用于SW1990細胞48 h后，與對照組相比較，大黃素單藥或聯(lián)合吉西他濱可顯著抑制NF-κB活性在胰腺癌SW1990細胞中的表達，而吉西他濱治療組可明顯上調NF-κB活性在胰腺癌SW1990細胞中的表達；大黃素(40μM)，吉西他濱(20μM)分別單獨或聯(lián)合用藥

6、作用于SW1990細胞48 h后，大黃素或聯(lián)合吉西他濱可以明顯抑制Bcl-2、Survivin的表達，但可以顯著上調Bax的表達，從而也降低了Bcl-2/Bax的比值，且能明顯抑制Pro-caspase3、8、9的表達。
　　 第二部分：大黃素對胰腺癌裸鼠SW1990細胞移植瘤的抑瘤作用及機制。
　　 目的：探討大黃素是否能增強吉西他濱對裸鼠SW1990細胞移植瘤的抑瘤作用及其可能的機制。
　　 方法：48只裸鼠

7、接種SW1990胰腺癌細胞，三周后，待所有的裸鼠種植瘤長徑均達≥5mm后將荷瘤鼠用隨機區(qū)組設計分成4個組，每組12只：生理鹽水組(N組)，大黃素組(E組：40 mg/kg)，吉西他濱組(G組：125 mg/kg)，聯(lián)合用藥組(E+G組：大黃素40 mg/kg+吉西他濱80 mg/kg)。各組均采取腹腔注射藥物，三天一次，前后共11次。觀察各組用藥過程中腫瘤體積的變化，末次用藥后一周進行活體熒光顯像檢測腫瘤變化，處死裸鼠后取腫瘤組織測出體

8、積后存放于液氮中，采用透射電鏡觀察腫瘤組織線粒體的變化；采用Tunel法檢測各組腫瘤組織凋亡情況；采用免疫組織化學染色法和Western Blot法檢測腫瘤組織Bax、Bcl-2、ActiveCaspase-9、Active Caspase-3、NF-κB(p65)和p-Akt的表達水平以及CytochromeC的釋放情況；通過凝膠電泳遷移分析(EMSA)檢測NF-κB與DNA結合活性的改變。
　　 結果：末次用藥后一周E+G組

9、腫瘤體積明顯小于其他各組?；铙w熒光顯像顯示與對照組相比，大黃素治療組腫瘤的個數(shù)減少，體積減小，聯(lián)合組治療效果更明顯。腫瘤組織細胞透射電鏡超微結構觀察所見，N組線粒體常見，形態(tài)較規(guī)則，結構良好，基質均勻，線粒體嵴完整；E組部分細胞線粒體腫脹，大小不一致，基質不均，線粒體嵴較對照組和G組稀少，部分嵴有斷裂；G組細胞線粒體較E組完整，可見某些線粒體腫脹，基質不均，嵴發(fā)育不良；E+G組線粒體大小不一，分布不均，基質不均勻，線粒體嵴發(fā)育不良且分布

10、不均，并可見線粒體膜破裂。Tunel法顯示E+G組腫瘤細胞凋亡比其余各組顯著增多。
　　 第三部分：大黃素對胰腺癌轉移及血管生成的影響及機制。
　　 目的：⑴觀察大黃素對胰腺癌轉移的影響；⑵觀察大黃素對胰腺癌血管生成的影響；⑶探討大黃素對胰腺癌轉移、血管生成的影響機制。
　　 方法：采用細胞劃痕試驗研究不同濃度大黃素(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)對胰腺癌SW1990細胞遷移的影響。采用T

11、ranswell侵襲實驗研究不同濃度大黃素對SW1990細胞侵襲能力的影響。在培養(yǎng)內皮祖細胞(EPCs)的基礎上，通過體內Matrigel plug法血管抑制實驗研究大黃素對體內血管生成的影響。制作裸鼠胰腺癌原位移植模型，將裸鼠隨機分為四組，術后第3周開始給藥，對照組每只腹腔注射生理鹽水0.2 mL；吉西他濱(100 mg/kg)腹腔注射；大黃素(50 mg/kg)灌胃；聯(lián)合組為吉西他濱(80 mg/kg)腹腔注射聯(lián)合大黃素(50 mg

12、/kg)灌胃。各組均為每周給藥3次，共治療兩周。用藥后4周末應用MicroPET對裸鼠進行掃描，處死裸鼠后測定瘤體重量，留取胰腺腫瘤、腸、肝臟、腹壁和腎，標本連續(xù)切片，HE染色，確定轉移范圍。通過腫瘤血管成像研究大黃素對胰腺癌血管生成的影響。免疫組化法檢測大黃素、吉西他濱和大黃素聯(lián)合吉西他濱對原位移植瘤組織中微血管內皮細胞標記物CD31、CD34和血管生成相關因子(VEGF、MMP-2、MMP-9和Survivin)的影響。Wester

13、n Blot法檢測大黃素、吉西他濱和大黃素聯(lián)合吉西他濱對原位移植瘤組織中血管生成相關基因(NF-κB及其調控因子VEGF、MMP-2、MMP-9、eNOS和Survivin)表達的影響。
　　 結果：細胞劃痕試驗顯示大黃素組(10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L)抑制胰腺癌細胞遷移，呈濃度依賴性，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)；Transwell侵襲實驗顯示大黃素可抑制體外胰腺癌SW1990細

14、胞侵襲，呈濃度依賴性，與對照組相比較，差異均有統(tǒng)計學(*P<0.05)；體內Matrigel plug法血管抑制實驗顯示：相對于EPCs組，大黃素+EPCs組顯著降低Matrigel膠中血紅蛋白含量，差異具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)。裸鼠原位移植瘤MicroPET掃描結果表明：吉西他濱和大黃素組的腫瘤/肌肉感興趣區(qū)的比值(ROI)較對照組均有顯著性差異(*P<0.05)，聯(lián)合組(1.55±0.058)較其他各組均有顯著性差異(**P

15、<0.05)；吉西他濱組和大黃素組的腫瘤標準攝取值(SUV)較對照組均有顯著性差異(*P<0.05)，聯(lián)合組較其他各組均有顯著性差異(**P<0.05)；與對照組相比，大黃素組和吉西他濱組均可明顯抑制胰腺原發(fā)腫瘤生長(*P<0.05)；另外，與對照組和各單藥組相比較，大黃素和吉西他濱聯(lián)合組可顯著抑制胰腺原發(fā)腫瘤生長(**P<0.05)。
　　 結論：①大黃素對胰腺癌SW1990細胞的增殖具明顯抑制作用，且有劑量和時間依賴性，能明

16、顯誘導胰腺癌SW1990細胞凋亡；大黃素聯(lián)合吉西他濱聯(lián)合作用時可具有協(xié)同增殖抑制和促凋亡作用。②大黃素可顯著抑制SW1990細胞中NF-κB活性及其下游蛋白Bcl-2、Survivin的表達，并上調Bax蛋白，降低Bcl-2/Bax比值，下調Pro-caspase3、8、9的表達，啟動線粒體凋亡途徑，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。③大黃素能顯著增強吉西他濱對裸鼠胰腺癌SW1990細胞移植瘤的抑瘤效果，其機制可能是大黃素通過抑制胰腺癌組織中A

17、kt和NF-κB的激活，抑制Bcl-2的表達，并促進Bax的表達，從而降低Bcl-2/Bax的比值，破壞腫瘤細胞線粒體結構及增加線粒體膜通透性，引起線粒體Cytochrome C釋放，通過觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應促使Caspase-9、Caspase-3激活，最終導致其增強吉西他濱對胰腺癌移植瘤的促凋亡作用。④大黃素可通過抑制胰腺癌血管生成而抑制胰腺癌的生長、轉移。⑤大黃素抑制胰腺癌血管生成，其機制可能與下調胰腺癌中NF-κB及其調控