CYLD介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路對(duì)胰腺癌的作用研究.pdf

1、目的：胰腺癌（PC）是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的2.4％，在美國(guó)，胰腺癌導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)死亡率排第四位，在我國(guó)排第6位。近年來(lái)，胰腺癌發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，且由于胰腺癌發(fā)病隱匿，發(fā)展速度快，手術(shù)切除率低，約20%-25%，術(shù)后5年生存率僅15%-20%，而失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期胰腺癌患者5年生存率低于1%。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)胰腺癌基因和分子水平的研究,進(jìn)一步探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制,提高胰腺癌的診治水平，改善預(yù)后。

2、　　研究表明，胰腺癌的生物學(xué)行為是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多種調(diào)節(jié)機(jī)制、多因素相互作用所導(dǎo)致的結(jié)果，其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。胰腺癌發(fā)生發(fā)展和多個(gè)抑癌基因的失活有著密切的關(guān)系，抑癌基因的表達(dá)沉默是胰腺癌一種主要的分子生物學(xué)改變。CYLD是一種細(xì)胞內(nèi)多功能去泛素化酶，作用于NF-κB、TGF-β及JNK等多條信號(hào)通路，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及血管生成等多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中

3、，發(fā)揮著抑癌基因的作用。CYLD在胰腺癌中的作用尚未見明確報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中，觀察了CYLD在胰腺癌中的表達(dá)情況及其與臨床參數(shù)之間的關(guān)系，并對(duì)其在胰腺癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。
　　方法：分別采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)胰腺癌新鮮癌組織和癌旁正常組織中 CYLD mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了胰腺癌組織石蠟包埋切片中CYLD的表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析了 CYLD表達(dá)

4、水平與胰腺癌臨床參數(shù)之間的關(guān)系。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中采用 Western blotting方法篩選 CYLD介于高表達(dá)和低表達(dá)之間的胰腺癌細(xì)胞系 PANC-1，而后分別以 CYLD-shRNA及pcDNA3.0(-)/CYLD轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞，CCK-8、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞增值、凋亡、侵襲及遷移能力，評(píng)估了PANC-1細(xì)胞中CYLD對(duì)NF-κB信號(hào)通路及其下游信號(hào)分子CyclinD1及

5、MMP9的影響。最后，采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)CYLD對(duì)成瘤的影響。
　　結(jié)果：
　　1、相比正常的胰腺組織，胰腺癌組織中CYLD蛋白及mRNA表達(dá)水平均有不同程度的降低。免疫組化顯示正常胰腺組織中，CYLD在胞漿及胞核中均有表達(dá)，而癌組織胞漿表達(dá)降低，胞核幾乎不表達(dá)。CYLD表達(dá)水平與胰腺癌患者的N分級(jí)(P=0.003)，AJCC分期(P=0.029)和組織分化程度顯著相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析顯示CYLD的表

6、達(dá)和胰腺癌患者的組織學(xué)分化程度(0.403，P=0.007)、AJCC分期(0.330，P=0.029)和 N分級(jí)(0.447，P=0.002)顯著相關(guān)。我們還采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗(yàn)分析了CYLD對(duì)患者總體生存的影響，結(jié)果顯示CYLD表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時(shí)間顯著相關(guān)(P=0.002)。CYLD CYLD高表達(dá)組平均生存時(shí)間為16.72個(gè)月（95% CI，14.12—19.31個(gè)月）,2年累積生存率為1

7、7%；而低表達(dá)的患者平均生存時(shí)間為8.27個(gè)月（95% CI，5.61—10.88個(gè)月），2年累積生存率為5.4%。多因素COX回歸分析顯示，CYLD表達(dá)水平（P＝0.014）、M分級(jí)（P＝0.041）和AJCC分期（P＝0.034）為胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　2、采用Western blotting及qRT-PCR法檢測(cè)了胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HDPE6-C7及人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、PANC-1、HPAC系中 CYLD蛋白及mR

8、NA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示4個(gè)細(xì)胞系中CYLD表達(dá)水平高低順序依次為 AsPC-1

9、YLD可有效增加PANC-1細(xì)胞中CYLD表達(dá)，并產(chǎn)生與上述相反之效應(yīng)。最后在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CYLD shRNA的PANC-1細(xì)胞中加入NF-κB抑制劑PTDC，發(fā)現(xiàn)PTDC能夠減弱CYLD shRNA所致的NF-κB活化，而過(guò)表達(dá)CYLD的PANC-1細(xì)胞中加入NF-κB激活劑TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CYLD能夠有效抑制TNF-α對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活作用。
　　3、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示pcDNA3.0(-)/CYLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC

10、-1細(xì)胞成瘤顯著小于對(duì)照組，且瘤組織 CYLD mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)CYLD抑制了裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：綜上所述，CYLD是一個(gè)新的具有一定診斷意義的生物學(xué)標(biāo)志物，并且對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后判斷有預(yù)測(cè)意義；CYLD通過(guò)抑制 NF-κB信號(hào)通路抑制了胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。過(guò)表達(dá) CYLD可以有效改善胰腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為并且抑制腫瘤的生長(zhǎng)，提示