鹽酸苯環(huán)壬酯及其旋光異構(gòu)體對NMDA神經(jīng)毒性的保護效應(yīng)及其作用機制.pdf

1、鹽酸苯環(huán)壬酯(phencynonate hydrochloride，PCH，)，商品名“飛賽樂”，是我所合成的中樞性抗膽堿能藥物，用于暈動病的治療，具有療效強，中樞不良反應(yīng)少的特點。已有研究提示苯環(huán)壬酯兼具有抗膽堿能和抗NMDA作用。由于其分子結(jié)構(gòu)中存在一個手性碳原子，苯環(huán)壬酯具有R(-)和S(+)兩種不同構(gòu)象。不同旋光異構(gòu)體對抗NMDA的效應(yīng)是否存在差異，其機制如何，目前尚不清楚。 谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性

2、神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞興奮性突觸傳遞，與突觸可塑性和長時程增強等重要生理過程有關(guān)。其受體可分為促離子型和促代謝型兩種。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體屬于離子型谷氨酸受體。包括NMDA受體在內(nèi)的谷氨酸受體的正?；钚詾榫S持生理功能所必需，然而其持續(xù)過度的活化卻會導致神經(jīng)元的死亡，這是急性腦損傷諸如癲癇、中風之后神經(jīng)細胞死亡的重要原因，也是許多慢性神經(jīng)退行性病變，如帕金森病(Parkinson’s

3、 disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等的發(fā)病及病程發(fā)展中的重要因素。不同的藥物可通過不同的途徑發(fā)揮抗興旮陛毒性的作用。然而，苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體通過何種機制達到神經(jīng)保護作用尚無研究報道。本研究通過比較PCH消旋體、R(-)-PCH和S(+)-PCH的抗NMDA神經(jīng)毒性效應(yīng)及其對大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響，旨在找到保護效應(yīng)強，不

4、良反應(yīng)少的優(yōu)性異構(gòu)體，為其進一步的合理開發(fā)利用提供研究參考，進而為NMDA：相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇；同時對其可能保護機制進行探索，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。 1 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體抗NMDA神經(jīng)毒性保護作用的比較 NMDA致死模型是檢驗藥物是否具有拮抗NMDA活性的唯一藥理終結(jié)點，具有可靠性強，易重復的特點，該致死效應(yīng)只能被苯環(huán)利定樣藥物和特異性NMDA受體拮抗劑阻斷。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鎘細胞瘤細胞，在神

5、經(jīng)生長因子(nerve growth factor)作用下細胞表達功能性的NMDA受體，廣泛用于細胞膜信號轉(zhuǎn)導與細胞內(nèi)信使、興奮性神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護機制的研究。 本研究建立NMDA的小鼠致死模型租PC12細胞損傷模型，通過并比較PCH不同旋光異構(gòu)體的神經(jīng)保護作用，旨在找到保護效應(yīng)更強的優(yōu)性異構(gòu)體，進而為NMDA相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇。結(jié)果表明，PCH不同旋光異構(gòu)體在體內(nèi)外均可對抗NMDA的損傷效應(yīng)。R(-)-PCH可以對

6、抗NDMA的致死效應(yīng)，顯著提高小鼠存活率，保護效應(yīng)優(yōu)于S(+)-PCH；PCH消旋體的最佳保護效應(yīng)與R(-)-PCH相當，但所需劑量高于R(-)-PCH。細胞存活率(MTT法)和LDH漏出檢測結(jié)果表明，R(-)-PCH可以顯著提高NMDA損傷作用后的細胞存活率，并有效抑制NMDA所致的細胞LDH漏出增加；S(+)-PCH對NMDA損傷后的細胞存活率無明顯影響，但可以有效抑制LDH的漏出；PCH消旋體的保護作用介于二者之間。R(-)-PC

7、H和PCH消旋體可明顯改善NMDA引起的細胞形態(tài)學病理改變，S(+)-PCH對形態(tài)學改變的保護作用相對較弱。 2 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體抗NMDA神經(jīng)毒性的保護作用機制 NMDA受體的過度激活導致胞內(nèi)Ca<'2+>超載并超出線粒體的承受能力，干擾了電子傳遞從而導致活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的生成。研究發(fā)現(xiàn)線粒體去極化的程度和Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡的程度呈現(xiàn)高度的一致性，但上述相

8、關(guān)性并不能被ROS的過量生成所解釋。為檢驗PCH的保護作用機制是否與阻斷NMDA所致的上述病理性改變有關(guān)，本研究對上述指標及其相互關(guān)系進行了研究。藥物處理后的PC12細胞分別用相應(yīng)的熒光探針(Hoechst 33258、Fluo-3/AM、Rhodamine 123、DCFH-DA)標記，采用激光共聚焦系統(tǒng)軟件Laserpix5.0程序采集處理細胞相差圖像及熒光圖像，并測定細胞平均熒光強度值。結(jié)果表明，PCH不同旋光異構(gòu)體對NMDA所致

9、的PC12細胞凋亡、胞內(nèi)Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體膜電位降低、ROS過量生成均有對抗作用。R(-)-PCH在抑制NMDA所致的上述細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)變化方面均顯示出比S(+)-PCH更強的保護效應(yīng)，與NMDA受體非特異性拮抗劑MK-801作用相當；PCH消旋體作用介于兩種旋光異構(gòu)體之間，也顯示出顯著性保護作用；而S(+)-PCH只對凋亡和ROS生成有顯著性抑制作用。結(jié)合第一部分實驗結(jié)果，R(-)-PCH可以顯著提高小鼠和PC12細胞存活率，

10、而S(+)-PCH卻無明顯效應(yīng)，不難得出：對Ca<'2+>超載和線粒體去極化的阻滯在PCH及其異構(gòu)體的保護作用機制中起重要作用，對ROS生成的阻滯在保護機制中并不發(fā)揮主要作用。 3 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體對大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響 本研究對PCH不同旋光異構(gòu)體對大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響進行比較，旨在找到不良反應(yīng)少的優(yōu)性異構(gòu)體，從而為NMDA相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇。Wistar大鼠隨機分為10組，每組10只，雌

11、雄各半，分別設(shè)為R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體3.5、7、14mg/kg 3個劑量組和生理鹽水對照1組。動物分離左側(cè)股總動脈作動脈插管同時氣管插管，單次灌胃給藥后記錄血壓、心電圖和心率，描記呼吸波形、記錄呼吸頻率及潮氣量。以每個時間點60s內(nèi)平均值作為評價指標。再以每組動物各個時間點上平均值的平均值和標準差與對照組進行比較。結(jié)果顯示，R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體對大鼠呼吸頻率、潮氣量和心率無明顯影響，不同旋

12、光異構(gòu)體對血壓均有降低趨勢，但劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯。 綜上，PCH不同旋光異構(gòu)體在體內(nèi)外均能對抗NMDA的神經(jīng)毒性作用。R(-)-PCH在體內(nèi)體外的保護效應(yīng)均優(yōu)于S(+)-PCH，保護作用與MK-801相當，是優(yōu)性異構(gòu)體，PCH消旋體的作用介于兩個旋光異構(gòu)體之間；抑制胞內(nèi)Ca<'2+>超載和線粒體的去極化在PCH及其異構(gòu)體的保護作用機制中起重要作用；在本實驗條件下R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體對大鼠呼吸頻率、潮氣量和