正壬基酚及其同分異構(gòu)體對(duì)小鼠Sertoli TM4細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、壬基酚（Nonylphenols，NPs）是一種環(huán)境毒性物質(zhì)和內(nèi)分泌干擾物，可對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害。事實(shí)上，壬基酚并不是單一的化合物，而是帶有一個(gè)苯環(huán)和九碳側(cè)鏈化合物的總稱，因此壬基酚存在多種同分異構(gòu)體。其中，九碳側(cè)鏈位于羥基對(duì)位的壬基酚被稱為對(duì)壬基酚或者是4-壬基酚，是最常見(jiàn)的壬基酚形式且是研究的重點(diǎn)對(duì)象，九碳側(cè)鏈為直鏈的4-NP稱為正-NP（4-n-NP）。壬基酚異構(gòu)體的生物效應(yīng)與其結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性，因此有必要研究單個(gè)壬基酚的

2、生物活性。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物主要通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)揮作用，一是通過(guò)激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞的增殖或者凋亡；另一個(gè)是通過(guò)激素受體介導(dǎo)引起內(nèi)分泌干擾作用。本論文以正壬基酚（4-n-NP）以及12種4-NP異構(gòu)體單體為研究對(duì)象，以Sertoli TM4細(xì)胞為靶細(xì)胞，運(yùn)用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和內(nèi)分泌干擾兩個(gè)方面研究4-NP異構(gòu)體對(duì)TM4細(xì)胞的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制，并通過(guò)比較差異探討4-NP異構(gòu)體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與其活性的相關(guān)性。本

3、文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論歸納如下：
　　1.4-NP異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
　　采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率以及流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低濃度時(shí)，NP9、NP10以及 NP37促進(jìn) TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)，4-n-NP、NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194處理顯著誘導(dǎo)TM4細(xì)胞的凋亡，由此可見(jiàn)除4-n-NP外，壬基取代基主碳鏈長(zhǎng)、取代基支鏈?。谆┑娜苫赢悩?gòu)體

4、可促進(jìn)TM4細(xì)胞增殖；碳鏈越短、α-C位置取代基基團(tuán)越大越復(fù)雜的壬基酚異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)越強(qiáng)。4-NP異構(gòu)體主要是通過(guò)引起細(xì)胞氧化損傷以及與ROS生成相關(guān)的線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在80-100μM時(shí)，所有4-NP異構(gòu)體通過(guò)直接毒性作用顯著降低TM4細(xì)胞的存活率。
　　2.4-NP異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響
　　用4-NP異構(gòu)體處理細(xì)胞24h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及

5、引起其變化的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194暴露能夠上調(diào)TM4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，其中NP65、NP70、NP111、NP152作用顯著。4-NP異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4內(nèi)鈣離子的調(diào)控作用與Ca2+-ATPase活性，鈣泵功能，鈣離子通道激酶等因素有關(guān)?？梢?jiàn)壬基酚取代基復(fù)雜、體積大（具有乙基或丙基取代基）的異構(gòu)體易導(dǎo)致TM4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度紊亂。
　　3.4-N

6、P異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞內(nèi)MAPK、Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　采用western blot的方法檢測(cè)了4-NP異構(gòu)體對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路和Akt信號(hào)通路的影響。4-n-NP、NP41、NP42、NP65、NP111、NP112、NP143、NP152均能激活JNK信號(hào)通路；4-n-NP、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194能夠激活p38信號(hào)通路；NP143、NP152、NP194對(duì)ERK信

7、號(hào)通路無(wú)影響，其他異構(gòu)體激活或抑制ERK通路。4-n-NP抑制Akt信號(hào)通路，其他所有檢測(cè)的NP異構(gòu)體能夠激活A(yù)kt信號(hào)通路。除4-n-NP外，壬基取代基大、α-C處取代基復(fù)雜的異構(gòu)體可激活JNK、p38信號(hào)通路，而對(duì)ERK信號(hào)通路無(wú)影響；碳鏈長(zhǎng)、壬基取代基簡(jiǎn)單的異構(gòu)體主要表現(xiàn)抑制JNK、p38信號(hào)通路。
　　4.4-NP異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞激素受體和分泌功能的影響
　　4-n-NP能夠降低TM4細(xì)胞內(nèi)ER-β

8、的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞連接相關(guān)分子的表達(dá)，上調(diào)ABP的分泌，下調(diào)inhibin B的分泌，且能增加TM4細(xì)胞對(duì)IL-1α、TNF-α、TGF-β1等的分泌，降低TM4細(xì)胞對(duì)NO的分泌和iNOS的表達(dá)。12種4-NP異構(gòu)體對(duì)TM4細(xì)胞激素受體、連接相關(guān)分子的表達(dá)以及內(nèi)分泌功能均具有不同程度的影響，4-NP異構(gòu)體可通過(guò)激素受體、連接相關(guān)分子的表達(dá)以及內(nèi)分泌功能對(duì)TM4細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
　　5.4-NP異構(gòu)體對(duì)Sertoli TM4細(xì)胞內(nèi)激素分

9、泌及其分子機(jī)制的研究
　　4-NP異構(gòu)體作用于細(xì)胞后，以PGE2為代表觀察4-NP異構(gòu)體對(duì)TM4細(xì)胞分泌激素的影響及其機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4-n-NP、NP10、NP41、NP42、NP70暴露能夠誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達(dá)和PGE2的釋放；NP9、NP37、NP65對(duì)TM4細(xì)胞內(nèi)PGE2的釋放無(wú)顯著影響；NP111、NP112、NP143、NP152、NP194可抑制TM4細(xì)胞對(duì)PGE2的釋放?？梢?jiàn)，壬基取代基主鏈長(zhǎng)（6-

10、7）且在β-C有取代基的異構(gòu)體刺激COX-2的表達(dá)和PGE2、IL-6的分泌；側(cè)鏈主鏈短（4-5）、在α-C處取代基比較大且復(fù)雜（乙基或丙基）的NP異構(gòu)體抑制TM4細(xì)胞分泌PGE2和IL-6。4-n-NP通過(guò)ROS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)和PGE2的釋放。
　　綜上所述，4-NP異構(gòu)體能夠通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（包括線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，鈣離子通道以及MAPK、Akt信號(hào)通路）和內(nèi)分泌干擾作用（包括對(duì)激素受體，