高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)IgG結(jié)合蛋白GST-GB2的研究.pdf

1、IgG結(jié)合蛋白GST-GB2是一種含有兩個(gè)IgG結(jié)合域的(B-domain)的外源重組蛋白,其在免疫學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。GST-GB2的廣泛應(yīng)用對(duì)此種蛋白的規(guī)?；a(chǎn)提出了更高的要求,搖瓶培養(yǎng)已不能適用。高密度培養(yǎng)技術(shù)作為一常用的重組大腸桿菌培養(yǎng)技術(shù)能夠顯著的提高單位體積內(nèi)的菌體量,從而提高外源重組蛋白的產(chǎn)量,已被廣泛的用于外源重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)。本研究在5 L發(fā)酵罐中通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌BL21(PGEX-G

2、B2)的高密度培養(yǎng),同時(shí)目的蛋白GST-GB2得到了高效的可溶性表達(dá),產(chǎn)量較搖瓶培養(yǎng)階段有顯著的提高。主要的研究?jī)?nèi)容如下;
　　 1選用了一種適合大腸桿菌高密度培養(yǎng)的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基,并根據(jù)所用菌種的特點(diǎn),優(yōu)化了培養(yǎng)基中葡萄糖與硫酸銨的濃度,發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為25mg/mL,硫酸銨濃度為4 mg/mL時(shí),菌體生長(zhǎng)情況最佳,搖瓶培養(yǎng)階段時(shí)最大菌體密度達(dá)到了5.32(OD600)。
　　 2根據(jù)培養(yǎng)基中富含葡萄糖的特點(diǎn),對(duì)該培

3、養(yǎng)基的滅菌方式進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)121℃,30 min,葡萄糖單獨(dú)滅菌,葡萄糖損耗僅為3.5％,為本研究中培養(yǎng)基的最佳滅菌方式。
　　 3在5 L發(fā)酵罐中的大腸桿菌高密度培養(yǎng)過程中,采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)方式,并在補(bǔ)料階段使用了三種完全不同的補(bǔ)料方式-恒速補(bǔ)料、pH反饋控制補(bǔ)料、溶氧反饋控制補(bǔ)料,三種補(bǔ)料方式都成功的實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的高密度培養(yǎng),菌體密度(OD600)都達(dá)到了100以上,最高值達(dá)到了116,進(jìn)一步比較了三種補(bǔ)料方式的

4、細(xì)胞得率系數(shù)YX/S和細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率rx,溶氧反饋控制補(bǔ)料方式下所得到的細(xì)胞的平均生長(zhǎng)速率的最大達(dá)到2.95g/L·h,細(xì)胞得率系數(shù)達(dá)到0.306g/g,確定溶氧反饋控制補(bǔ)料是最佳的補(bǔ)料方式。
　　 4在采用溶氧反饋控制補(bǔ)料的高密度培養(yǎng)的蛋白誘導(dǎo)階段,研究了誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白GST-GB2產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)劑加入6 h后細(xì)胞中可溶性目的蛋白的濃度達(dá)到最大,達(dá)到4.12 g/L,比搖瓶培養(yǎng)階段提高了2.81倍,直接ELISA分