基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白及其分離純化.pdf

1、本文主要研究了基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白及其分離純化的過程。考察了三種不同的控氧方式，即葡萄糖反饋、提高罐壓、富氧通氣；四種不同間歇周期的補(bǔ)氮操作，即每隔25s補(bǔ)加補(bǔ)料氮溶液1.5mL(1.5mL/25s)、18mL/5min、36mL/10min、72mL/20min；誘導(dǎo)條件，即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、發(fā)酵液中乙酸濃度、誘導(dǎo)強(qiáng)度；對細(xì)胞生長和目標(biāo)蛋白(類人膠原蛋白)表達(dá)的影響。對細(xì)胞生長和類人膠原蛋白表達(dá)的動力學(xué)、代謝途徑通量進(jìn)行

2、了分析。研究了批量離子交換層析和凝膠過濾層析相結(jié)合的方法對類人膠原蛋白進(jìn)行純化的控制工藝。結(jié)果表明： 1.采用提高罐壓的控氧方式控制發(fā)酵液中溶解氧在培養(yǎng)過程中維持于20％～30％飽和度，可以使最終的細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)到77.3g·L-1，類人膠原蛋白的表達(dá)量為13.9g·L-1，均高于葡萄糖反饋和富氧通氣兩種控氧方式下的細(xì)胞產(chǎn)量和類人膠原蛋白表達(dá)量； 2.當(dāng)補(bǔ)料氮溶液的添加方式為36mL/10min時(shí)，最終細(xì)胞產(chǎn)量可達(dá)到84

3、g·L-1，類人膠原蛋白的表達(dá)量為14g·L-1，分別為四種補(bǔ)氮周期操作方式下的最大者； 3.當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中后期時(shí)，升溫至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)，可使最終的類人膠原蛋白表達(dá)量達(dá)到10.3g·L-1，要高于當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期和后期時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)類人膠原蛋白的表達(dá)量； 4.發(fā)酵液中代謝副產(chǎn)物乙酸的存在對細(xì)胞生長和類人膠原蛋白的表達(dá)均可產(chǎn)生非常顯著的影響。當(dāng)發(fā)酵液中乙酸鈉的添加量為3.0g·L-1時(shí)，最終細(xì)胞產(chǎn)量和類人

4、膠原蛋白的產(chǎn)量僅為43.3g·L-1和2.0g·L-1，類人膠原蛋白產(chǎn)量僅為不添加乙酸鈉時(shí)的20％； 5.誘導(dǎo)強(qiáng)度對最終類人膠原蛋白的產(chǎn)量可產(chǎn)生顯著的影響。42℃保持時(shí)間太短，細(xì)胞誘導(dǎo)不夠充分；42℃保持時(shí)間太長，細(xì)胞活性部分喪失，對產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)生不利影響。當(dāng)采用42℃誘導(dǎo)3h后降溫至39℃繼續(xù)誘導(dǎo)5h的策略時(shí)，最終的細(xì)胞產(chǎn)量和類人膠原蛋白產(chǎn)量分別為78.5g·L-1和v12.8g·L-1，均為四種誘導(dǎo)方式中最高； 6

5、.根據(jù)培養(yǎng)過程中不同時(shí)間段的不同特性，將整個(gè)發(fā)酵過程劃分為三個(gè)階段，即批式培養(yǎng)階段、誘導(dǎo)前補(bǔ)料培養(yǎng)階段以及誘導(dǎo)階段。運(yùn)用數(shù)學(xué)工具M(jìn)ATLAB對發(fā)酵過程采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可得到三個(gè)階段的細(xì)胞生長、底物消耗和類人膠原蛋白表達(dá)的動力學(xué)模型：(1)批式培養(yǎng)階段dX/dt=0.6978×S*X/0.0149+SdS/dt=-0.6978×S*X/0.4297×(0.0149+S)-0.0084X (2)誘導(dǎo)前補(bǔ)料培養(yǎng)階段dX/dt=1

6、.3836(X-X2/106.8928)/0.0792X+2-X/498[2.8122(X-X2/106.8928)/0.0792X+2+0.0073X] (3)誘導(dǎo)階段dX/dt=1.3956X/0.0627X+2(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)-X/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0.0627X+S(

7、1-X/76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X]dV/dt=V/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0627X+S(1-X/)76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X]dP/dt=(0.3956X/0.0627X+S(1-X/76.9637)+0.055)(1-P/24.5

8、785)X-P/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0627X+S(1-X/)76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X] 7.對代謝途徑中間代謝反應(yīng)采用擬穩(wěn)態(tài)處理，進(jìn)行代謝通量分析(MFA)，結(jié)果表明： (1)誘導(dǎo)以前的補(bǔ)料培養(yǎng)階段，三種不同控氧方式下細(xì)胞的代謝通量存在一定差異，其中葡萄

9、糖反饋方式下，進(jìn)入PP途徑的代謝通量分率最高，從代謝的角度證明了葡萄糖反饋的控氧方式下細(xì)胞的得率最高。 (2)誘導(dǎo)以前的補(bǔ)料培養(yǎng)階段，四種不同補(bǔ)氮方式下細(xì)胞的代謝通量也存在一定差異，當(dāng)補(bǔ)料氮溶液的添加方式為36mL/10min時(shí)，進(jìn)入PP途徑的代謝通量分率最高，而進(jìn)入EMP途徑和TCA循環(huán)的代謝通量分率最?。?(3)誘導(dǎo)以后，三種不同控氧方式下細(xì)胞進(jìn)入PP途徑的代謝通量均比誘導(dǎo)前顯著下降。其中富氧通氣的控氧方式下，P

10、P途徑的代謝通量下降幅度最大，也達(dá)到了三種控氧方式中的最低。而提高罐壓的操作方式下進(jìn)入TCA循環(huán)的代謝通量最高，以提供產(chǎn)物合成所需的前體需求； (4)誘導(dǎo)以后，四種不同補(bǔ)氮方式下細(xì)胞進(jìn)入PP途徑的代謝通量也均比誘導(dǎo)前顯著下降。其中，當(dāng)補(bǔ)料氮溶液的添加方式為36mL/10min時(shí)，誘導(dǎo)以后進(jìn)入PP途徑的代謝通量仍舊最高。 8.選取陰離子交換樹脂DEAE52來吸附雜蛋白，緩沖體系采用Tris-鹽酸，pH值為7.0，NaC