適用于高密度發(fā)酵的產(chǎn)聚羥基烷酸重組大腸桿菌的構(gòu)建.pdf

1、聚羥基烷酸脂(PHA)是一類生物可降解塑料，具有許多優(yōu)良特性和很好的應(yīng)用前景，近年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和材料工程中發(fā)展很快。目前，PHA的生產(chǎn)主要是微生物發(fā)酵法，研究方向主要圍繞新型PHA的合成、PHA生產(chǎn)成本的降低等方面。本實(shí)驗(yàn)研究的是聚羥基丁酸(PHB)。 為了提高PHB產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，本室利用透明顫菌血紅蛋白(vhb)與氧結(jié)合的能力構(gòu)建能在高密度發(fā)酵過程中維持高溶氧的產(chǎn)PHB工程菌株，將編碼VHb蛋白的基因在質(zhì)粒上高拷貝表達(dá)和

2、整合到染色體上(低拷貝表達(dá))都沒有達(dá)到預(yù)期效果，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建VHb蛋白重組表達(dá)載體，將vhb結(jié)構(gòu)基因置于tac啟動子后，使VHb蛋白在IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)下，構(gòu)建E.coliHMS174(pDK101V)。搖瓶培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在菌體對數(shù)生長后期加入IPTG對菌體的生長影響最大，當(dāng)在23h加入誘導(dǎo)劑時(shí)，E.coliHMS174(pDK101V)最終菌體濃度OD600達(dá)到32.4，PHB含量達(dá)到78.4％，而對照菌株E.coliHMS174(pDK

3、101V)在不加誘導(dǎo)劑的情況下，最終菌體濃度OD600達(dá)到21.6，PHB含量達(dá)到70.8％。在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，在對數(shù)生長后期誘導(dǎo)VHb蛋白表達(dá)，最終工程菌菌體密度OD600達(dá)到96.4，PHB含量達(dá)到了50.2％；E.coliHMS174(pDK101V)在不加誘導(dǎo)劑的情況下菌體密度OD600達(dá)到120.6，PHB含量達(dá)到62.4％。 本實(shí)驗(yàn)利用mini-Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變E.coliHMS174，在溴化鈉-溴酸鈉篩選平

4、板上篩選產(chǎn)酸少的突變株，通過搖瓶實(shí)驗(yàn)獲得突變菌株E.coliT13，將含有phb操縱元和維持質(zhì)粒穩(wěn)定的parDE基因的質(zhì)粒pTZ101轉(zhuǎn)化E.coliT13，構(gòu)建工程菌株E.coliT13(pTZ101)，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，突變株乙酸產(chǎn)量降低，最終菌體密度OD600達(dá)到78.6，PHB含量為52.4％，對照菌株E.coliHMS174(pTZ101)菌體密度OD600達(dá)到98.4，PHB含量達(dá)到55.8％，而突變株的產(chǎn)乙酸的量是對照菌