適用于高密度發(fā)酵的產聚羥基烷酸重組大腸桿菌的構建.pdf

1、聚羥基烷酸脂(PHA)是一類生物可降解塑料，具有許多優(yōu)良特性和很好的應用前景，近年來在醫(yī)學領域和材料工程中發(fā)展很快。目前，PHA的生產主要是微生物發(fā)酵法，研究方向主要圍繞新型PHA的合成、PHA生產成本的降低等方面。本實驗研究的是聚羥基丁酸(PHB)。 為了提高PHB產量，降低生產成本，本室利用透明顫菌血紅蛋白(vhb)與氧結合的能力構建能在高密度發(fā)酵過程中維持高溶氧的產PHB工程菌株，將編碼VHb蛋白的基因在質粒上高拷貝表達和

2、整合到染色體上(低拷貝表達)都沒有達到預期效果，本實驗構建VHb蛋白重組表達載體，將vhb結構基因置于tac啟動子后，使VHb蛋白在IPTG的誘導表達下，構建E.coliHMS174(pDK101V)。搖瓶培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在菌體對數(shù)生長后期加入IPTG對菌體的生長影響最大，當在23h加入誘導劑時，E.coliHMS174(pDK101V)最終菌體濃度OD600達到32.4，PHB含量達到78.4％，而對照菌株E.coliHMS174(pDK

3、101V)在不加誘導劑的情況下，最終菌體濃度OD600達到21.6，PHB含量達到70.8％。在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時，在對數(shù)生長后期誘導VHb蛋白表達，最終工程菌菌體密度OD600達到96.4，PHB含量達到了50.2％；E.coliHMS174(pDK101V)在不加誘導劑的情況下菌體密度OD600達到120.6，PHB含量達到62.4％。 本實驗利用mini-Tn5轉座子隨機突變E.coliHMS174，在溴化鈉-溴酸鈉篩選平

4、板上篩選產酸少的突變株，通過搖瓶實驗獲得突變菌株E.coliT13，將含有phb操縱元和維持質粒穩(wěn)定的parDE基因的質粒pTZ101轉化E.coliT13，構建工程菌株E.coliT13(pTZ101)，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，突變株乙酸產量降低，最終菌體密度OD600達到78.6，PHB含量為52.4％，對照菌株E.coliHMS174(pTZ101)菌體密度OD600達到98.4，PHB含量達到55.8％，而突變株的產乙酸的量是對照菌