環(huán)氧化二十碳三烯酸對血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞活性氧產(chǎn)生的作用和機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 環(huán)氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的表氧化酶代謝產(chǎn)物。它們由細胞色素P450表氧化酶代謝產(chǎn)生，作為參與體內(nèi)多種生物活動的重要脂質(zhì)中介物。EETs對于調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要的作用，它能促進內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達和提高其活性以增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成從而保護內(nèi)皮功能；能抑制內(nèi)皮

2、細胞炎癥因子和粘附分子的表達；能促進內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成；能抑制血管平滑肌細胞的增殖和移行；還能促進組織型纖溶酶原激活物的表達促進纖溶而發(fā)揮抗凝血的效應(yīng)，這些都證明了EETs對于心血管系統(tǒng)起廣泛的保護作用。氧化應(yīng)激（oxidative stress）與機體的多種疾病聯(lián)系緊密，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腎病以及腫瘤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)具有滅活NO從而損害內(nèi)皮依賴的血管

3、舒張反應(yīng)、促進炎癥細胞的粘附、促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移等效應(yīng)。這些效應(yīng)使得ROS促進了動脈粥樣硬化、高血壓、血管形成術(shù)后再狹窄、心血管重塑、心衰等心血管疾病的病理生理過程的發(fā)生和發(fā)展。既然EETs在維持心血管穩(wěn)態(tài)中起到了重要的作用，而氧化應(yīng)激和活性氧是心血管的“不穩(wěn)定因素”之一，這二者之間是否有聯(lián)系？目前還未有研究。探討EETs對心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激及ROS產(chǎn)生的影響，可以明確EETs的生理作用、為心血管系統(tǒng)疾病的防治提供靶點和理論

4、依據(jù)。同時，我們還首次發(fā)現(xiàn)EETs促進人類腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用。而ROS亦是腫瘤細胞凋亡信號的重要調(diào)節(jié)分子，在缺氧、藥物、受體介導等各種因素誘導的腫瘤細胞凋亡中起到重要作用。ROS升高可以誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，抗氧化劑可以抑制凋亡。因此，本文還研究了EETs抑制腫瘤細胞凋亡是否和ROS有關(guān)，以期完善我們前期的研究成果，深化EETs對腫瘤細胞的作用機制。
　　 實驗方法：
　　 體外培養(yǎng)的牛主動脈

5、內(nèi)皮細胞（bovine arotic endothelial cells，BAECs）用EETs預(yù)處理24小時，接著用血管緊張素II（angiotensin II，Ang Ⅱ）處理1小時，使其胞內(nèi)ROS升高，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生。用western blot的方法檢測不同時間EET處理的內(nèi)皮細胞NAD(P)H氧化酶各亞單位的表達和抗氧化酶超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的表達，用生化方法檢測其活性。分離細胞胞漿和胞膜蛋白，用wes

6、tern blot的方法分別檢測胞漿和胞膜NAD(P)H氧化酶各亞單位的分布和Rac1 GTP酶的膜轉(zhuǎn)位。在腫瘤細胞中，用三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）誘導人舌鱗癌細胞Tca-8113 ROS的產(chǎn)生和細胞凋亡。同樣用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生和細胞凋亡，用比色法測定caspase活性，JC-1測定線粒體膜電位，western blot檢測抗氧化酶的表達和氧化還原敏感的相關(guān)信號通路的改變。
　　 實驗

7、結(jié)果：
　　 1.EETs對體外培養(yǎng)的BAECs活性氧產(chǎn)生的作用及機制通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：用EETs預(yù)處理的24h后，能明顯抑制Ang Ⅱ誘導的BAECs的ROS生成。通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)可能是通過抑制NAD(P)H氧化酶的亞單位gp91phox的表達；抑制NAD(P)H氧化酶的胞漿組份p47phox和rac1的膜轉(zhuǎn)位和上調(diào)抗氧化酶超氧化物歧化酶的表達和活性來實現(xiàn)的。
　　 2.EET對腫

8、瘤細胞的活性氧產(chǎn)生的作用及機制EET同樣能抑制ATO導致的腫瘤細胞的活性氧產(chǎn)生以及細胞凋亡，它還能抑制ATO導致的線粒體膜電位的丟失、caspase 9和3的激活以及P38、JNK等信號通路的激活。抑制CYP2J2的活性能和ATO起到協(xié)同作用，增加腫瘤細胞的ROS產(chǎn)生和促進腫瘤細胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗通過體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，利用分子生物學和細胞生物學技術(shù)，對EET在活性氧的調(diào)節(jié)及其機制進行了研究，

9、得出以下結(jié)論：
　　 1.EET抑制Ang Ⅱ誘導的BAECs活性氧產(chǎn)生，其機制可能是抑制了NAD(P)H氧化酶主要亞單位的表達和膜轉(zhuǎn)位以及上調(diào)抗氧化酶的表達和活性，AMPK、PPAR-γ、ERK途徑可能是EET發(fā)揮抗氧化效應(yīng)的機制。
　　 2.EET同時也抑制了腫瘤細胞內(nèi)由ATO誘導的ROS產(chǎn)生。還能抑制ROS介導的線粒體途徑的細胞凋亡，完善了關(guān)于EET抑制細胞凋亡的相關(guān)機制。同時，抑制CYP2J2能夠增強ATO對