環(huán)氧化二十碳三烯酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的作用和機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 環(huán)氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的表氧化酶代謝產(chǎn)物。它們由細(xì)胞色素P450表氧化酶代謝產(chǎn)生，作為參與體內(nèi)多種生物活動(dòng)的重要脂質(zhì)中介物。EETs對(duì)于調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要的作用，它能促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)和提高其活性以增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成從而保護(hù)內(nèi)皮功能；能抑制內(nèi)皮

2、細(xì)胞炎癥因子和粘附分子的表達(dá)；能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成；能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行；還能促進(jìn)組織型纖溶酶原激活物的表達(dá)促進(jìn)纖溶而發(fā)揮抗凝血的效應(yīng)，這些都證明了EETs對(duì)于心血管系統(tǒng)起廣泛的保護(hù)作用。氧化應(yīng)激（oxidative stress）與機(jī)體的多種疾病聯(lián)系緊密，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腎病以及腫瘤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)具有滅活NO從而損害內(nèi)皮依賴的血管

3、舒張反應(yīng)、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等效應(yīng)。這些效應(yīng)使得ROS促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管形成術(shù)后再狹窄、心血管重塑、心衰等心血管疾病的病理生理過程的發(fā)生和發(fā)展。既然EETs在維持心血管穩(wěn)態(tài)中起到了重要的作用，而氧化應(yīng)激和活性氧是心血管的“不穩(wěn)定因素”之一，這二者之間是否有聯(lián)系？目前還未有研究。探討EETs對(duì)心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激及ROS產(chǎn)生的影響，可以明確EETs的生理作用、為心血管系統(tǒng)疾病的防治提供靶點(diǎn)和理論

4、依據(jù)。同時(shí)，我們還首次發(fā)現(xiàn)EETs促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。而ROS亦是腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)的重要調(diào)節(jié)分子，在缺氧、藥物、受體介導(dǎo)等各種因素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中起到重要作用。ROS升高可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，抗氧化劑可以抑制凋亡。因此，本文還研究了EETs抑制腫瘤細(xì)胞凋亡是否和ROS有關(guān)，以期完善我們前期的研究成果，深化EETs對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 體外培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈

5、內(nèi)皮細(xì)胞（bovine arotic endothelial cells，BAECs）用EETs預(yù)處理24小時(shí)，接著用血管緊張素II（angiotensin II，Ang Ⅱ）處理1小時(shí)，使其胞內(nèi)ROS升高，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生。用western blot的方法檢測(cè)不同時(shí)間EET處理的內(nèi)皮細(xì)胞NAD(P)H氧化酶各亞單位的表達(dá)和抗氧化酶超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的表達(dá)，用生化方法檢測(cè)其活性。分離細(xì)胞胞漿和胞膜蛋白，用wes

6、tern blot的方法分別檢測(cè)胞漿和胞膜NAD(P)H氧化酶各亞單位的分布和Rac1 GTP酶的膜轉(zhuǎn)位。在腫瘤細(xì)胞中，用三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113 ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。同樣用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，用比色法測(cè)定caspase活性，JC-1測(cè)定線粒體膜電位，western blot檢測(cè)抗氧化酶的表達(dá)和氧化還原敏感的相關(guān)信號(hào)通路的改變。
　　 實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果：
　　 1.EETs對(duì)體外培養(yǎng)的BAECs活性氧產(chǎn)生的作用及機(jī)制通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：用EETs預(yù)處理的24h后，能明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的BAECs的ROS生成。通過western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)可能是通過抑制NAD(P)H氧化酶的亞單位gp91phox的表達(dá)；抑制NAD(P)H氧化酶的胞漿組份p47phox和rac1的膜轉(zhuǎn)位和上調(diào)抗氧化酶超氧化物歧化酶的表達(dá)和活性來實(shí)現(xiàn)的。
　　 2.EET對(duì)腫

8、瘤細(xì)胞的活性氧產(chǎn)生的作用及機(jī)制EET同樣能抑制ATO導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的活性氧產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡，它還能抑制ATO導(dǎo)致的線粒體膜電位的丟失、caspase 9和3的激活以及P38、JNK等信號(hào)通路的激活。抑制CYP2J2的活性能和ATO起到協(xié)同作用，增加腫瘤細(xì)胞的ROS產(chǎn)生和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，對(duì)EET在活性氧的調(diào)節(jié)及其機(jī)制進(jìn)行了研究，

9、得出以下結(jié)論：
　　 1.EET抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的BAECs活性氧產(chǎn)生，其機(jī)制可能是抑制了NAD(P)H氧化酶主要亞單位的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位以及上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)和活性，AMPK、PPAR-γ、ERK途徑可能是EET發(fā)揮抗氧化效應(yīng)的機(jī)制。
　　 2.EET同時(shí)也抑制了腫瘤細(xì)胞內(nèi)由ATO誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。還能抑制ROS介導(dǎo)的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，完善了關(guān)于EET抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。同時(shí)，抑制CYP2J2能夠增強(qiáng)ATO對(duì)