血清多肽Pep4及相關(guān)肽聯(lián)合檢測腫瘤的初步研究.pdf

1、目的:
　　開發(fā)高靈敏度、高特異性的血清多肽標(biāo)志物及其檢測技術(shù)，聯(lián)合檢測多種多肽類標(biāo)志物，對腫瘤等重大疾病的早期篩查均具有非常重要的意義。Pep4及相關(guān)肽(Pep9、Pep15)是前期篩選出的腫瘤候選血清多肽標(biāo)志物，對該標(biāo)志物的檢測方法和應(yīng)用價(jià)值尚未進(jìn)行深入研究。本論文旨在建立檢測候選血清多肽標(biāo)志物Pep4及相關(guān)肽(Pep9、Pep15)的ELISA方法，初步評(píng)價(jià)該標(biāo)志物在不同類型臨床腫瘤樣本中的表達(dá)水平及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并進(jìn)一步探

2、討多標(biāo)志物聯(lián)合檢測對提高腫瘤診斷效率的促進(jìn)作用。
　　方法:
　　本論文采用碳二亞胺法分別制備了Pep4、Pep9及Pep15的偶聯(lián)抗原，通過動(dòng)物免疫制備鼠源單克隆抗體。所制備的抗體分別進(jìn)行親和層析法純化、過碘酸鈉氧化法標(biāo)記HRP酶?？疾觳煌嚯目乖c抗體反應(yīng)的最佳條件，建立合適的ELSIA方法并進(jìn)行方法學(xué)考察。將所建立的ELISA方法應(yīng)用到6種腫瘤血清樣本的（共計(jì)192例）檢測，采用Medcalc分析軟件對Pep4及相關(guān)肽

3、在不同腫瘤中的表達(dá)水平進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　獲得3株(2B7、7D8、5A7)抗Pep4的雜交瘤細(xì)胞株，純化抗體的效價(jià)分別為1∶320000、1∶160000、1∶160000。獲得2株(2B7、3D11)可抗Pep9、Pep15的雜交瘤細(xì)胞株，其中純化后的3D11對Pep9、Pep15的效價(jià)分別為1∶2000、1∶4000。純化后的抗體經(jīng)HRP酶標(biāo)記處理，效價(jià)無明顯影響。對3種ELISA方法（夾心法、直接法、

4、間接法）的血清檢測結(jié)果進(jìn)行比對，確定間接ELISA法更適合于檢測血清中的Pep4，其中抗體2B7稀釋度1∶20000，線性范圍80～1000ng/mL(r=0.9946)，該法可區(qū)分6種腫瘤與正常樣本，且各腫瘤組間差異顯著(P＜0.05)，對肝癌和乳腺癌的檢測敏感性和特異性均＞90％。建立“蛋白-多肽組合式”雙抗體夾心ELISA法檢測Pep9和Pep15?？贵wIgG-HKa包被量為100ng/孔，標(biāo)記抗體“HRP-IgG-相關(guān)肽”1∶1

5、000稀釋后檢測，本方法的線性范圍6～120ng/mL(r=0.9997)，最低檢測限1.7ng/mL。該法能顯著區(qū)分腫瘤組與正常組，且在部分腫瘤組間存在差異，對腸癌的檢測靈敏度及特異性最高。對比分析pep4和Pep9、Pep15的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該類標(biāo)志物對食管癌的診斷具有較高一致性(Kappa=0.55);兩組標(biāo)志物聯(lián)合檢測的結(jié)果與臨床診斷結(jié)果具有較高一致性(Kappa＞0.6)，其中對乳腺癌的聯(lián)合診斷效果最好(Kappa=0.83)

6、。
　　結(jié)論:
　　多肽Pep4及相關(guān)肽的雜交瘤細(xì)胞株特異性好、抗體活性高，為本文的ELISA方法建立和標(biāo)志物聯(lián)合檢測提供了合格與充足的免疫學(xué)研究原材料。針對不同的多肽標(biāo)志物，建立了多種ELISA方法，其中間接ELISA法適用于pep4的檢測，而“蛋白-多肽組合式”雙抗夾心ELSIA適用于相關(guān)肽的檢測，并實(shí)現(xiàn)了多標(biāo)志物聯(lián)合檢測。通過不同腫瘤樣本和正常樣本的檢測，驗(yàn)證了多肽Pep4及相關(guān)肽在腫瘤診斷中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可作為多種