腫瘤相關(guān)基因t351的初步研究.pdf

1、在腫瘤免疫治療中，抗體靶向治療因其特異性強、靶向性高和治療過程相對較短而備受重視?？贵w靶向治療包括：抗腫瘤單克隆抗體直接體內(nèi)應(yīng)用；抗腫瘤單克隆抗體與抗腫瘤藥物、生物毒素或同位素偶聯(lián)，通過抗腫瘤單抗將效應(yīng)分子引導(dǎo)至腫瘤局部，殺傷腫瘤等。目前，在國外已有8種治療型抗體藥物被批準正式進入臨床，用于腫瘤治療。同時，將抗體偶聯(lián)上放射性核素用于腫瘤診斷也已經(jīng)在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。本課題的目的即通過對腫瘤相關(guān)基因T351特異性抗體的治療腫瘤作用

2、的研究，為治療型抗體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 在研制腫瘤治療和診斷型抗體時，有效的腫瘤抗原和相應(yīng)的高特異性抗體是兩個關(guān)鍵因素。在前期工作中利用差異顯示發(fā)現(xiàn)了一個肺癌高表達新基因t351，為了將其開發(fā)成具有腫瘤診斷或(和)腫瘤治療價值的單克隆抗體，本文做了以下研究： 一、利用生物信息學(xué)方法，對t351基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，功能和細胞定位進行了分析和預(yù)測。分析結(jié)果表明，該基因編碼蛋白是與物質(zhì)運輸有關(guān)的膜定位蛋白，具有6個跨膜區(qū)。利用R

3、T-PCR及實時定量PCR方法，在mRNA水平對t351基因在多發(fā)腫瘤及瘤旁組織和多種腫瘤細胞系中的表達情況進行了研究。結(jié)果顯示，該基因在腫瘤組織和腫瘤細胞系中呈廣泛高表達，其腫瘤組織中的表達水平是相應(yīng)癌旁組織的1.3～9.2倍。 二、根據(jù)對糖基化和磷酸化位點的預(yù)測結(jié)果，選取了編碼胞外區(qū)的一段基因序列進行表達。構(gòu)建了所選t351基因片段的原核表達質(zhì)粒pET25b(+)—351philic。經(jīng)過轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL—21，IPT

4、G誘導(dǎo)表達，純化等一系列工作，獲得了該基因的編碼重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE，Western等方法鑒定，得到的蛋白純度較高，可以用來作為抗原制備相應(yīng)的單克隆抗體。 三、用制備的蛋白免疫BALB/C小鼠，通過經(jīng)典雜交瘤技術(shù)，制備出了針對t351蛋白親水片斷的單克隆抗體。經(jīng)過對得到單抗的一系列鑒定，篩選出三株雜交瘤細胞，C1—1，C1—8和C6—5。這三株雜交瘤細胞抗體效價高，可結(jié)合原核表達的t351蛋白親水片段以及高表達t351基

5、因的細胞膜蛋白。將雜交瘤小鼠腹腔注射獲得腹水，經(jīng)純化得到了高純度的單克隆抗體。 四、以得到的單抗為工具，經(jīng)免疫組化，流式細胞分析，從蛋白水平分析了t351基因在腫瘤組織和腫瘤細胞系細胞的表達，以及其在組織和細胞中的定位情況。結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白在腫瘤組織和細胞都有較高的表達。免疫組化結(jié)果還觀察到該蛋白同時表達在胞漿和胞膜。 五、以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞為效應(yīng)細胞，腫瘤細胞HepG2，HT29和GLC—82為靶細

6、胞，t351蛋白單抗C1—1為中介，行ADCC實驗；研究該抗體作為治療型抗體的可行性。結(jié)果表明，C1—1介導(dǎo)了較高的殺傷效應(yīng)，可進一步用于腫瘤免疫治療的研究。 六、用放射性核素99mTc標記單抗C1—1，做體外結(jié)合腫瘤細胞實驗和荷瘤小鼠體內(nèi)顯影。二者結(jié)果均不理想。其可能原因是標記抗體條件不適合，使得標記后抗體對細胞的結(jié)合下降。 綜上所述，t351基因是一個在腫瘤中廣泛表達和高表達的基因，其編碼蛋白為膜蛋白，可以做為腫瘤免