應用小干擾RNA研究Erβ在青春期椎體線性生長中的作用.pdf

1、目的:構(gòu)建成ERβ特異性打靶的基因沉默載體,并將其包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。分別轉(zhuǎn)染目的細胞和小鼠,構(gòu)建ERβ基因沉默的細胞模型和動物模型。在細胞水平上,研究ERβ對成骨細胞的增殖能力的調(diào)控作用和細胞因子OPG和RANKL的分泌和表達的調(diào)控作用。在動物水平的上,初步研究ERβ在青春期脊柱椎體線性生長中的作用,及其對部分主要細胞因子的調(diào)控作用。
　　方法:登陸genbank網(wǎng)站檢索小鼠ERβ cDNA序列的2個轉(zhuǎn)錄本。利用Ambion公

2、司的“SiRNA Target Finder”軟件設計針對ERβmRNA的siRNA序列,構(gòu)建成ERβ特異性打靶的基因沉默載體。檢測并篩選對ERβ沉默效果最佳者包裝成為病毒顆粒。以小鼠成骨細胞株MC3T3-E1為對象,設立3組,其中2個組分別轉(zhuǎn)染ERβ RNAi載體和陰性對照ERLRNAi載體,第3組為空白對照組。3組在相同條件下培養(yǎng)。然后,繪制各組細胞的生長曲線;分析各組細胞的細胞周期;檢測各組細胞堿性磷酸酶(ALP)活性;檢測各組細

3、胞形成鈣結(jié)節(jié);檢測各組細胞中OPG、RANKL表達的變化。取昆明小鼠36只,其中雌性和雄性各18只,分別隨機分為3組,分別為ERβ RNAi組、空白對照組和陰性對照組。制備ERβ沉默動物模型。分別于動物模型制作當天、2周、4周和6周測量小鼠身長、體重。6周后,制作各組小鼠椎體組織切片分別進行HE染色和Masson三色染色觀察椎體骺板軟骨細胞層的變化及骨小梁密度的差異;通過TUNEL檢測椎體內(nèi)細胞凋亡情況的差異;采用免疫組化的方法進行檢測

4、細胞因子OPG和RANKL的表達差異。用SPSS16.0軟件分析各組差異的顯著性。
　　結(jié)果:所設計的2條RNAi打靶序列均在小鼠ERβ兩個基因轉(zhuǎn)錄本中存在同源序列,但在小鼠其它基因組中未發(fā)現(xiàn)同源組序,可以同時打靶ERβ的兩個轉(zhuǎn)錄本。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒測序證明重組質(zhì)粒DNA中含有shRNA序列。經(jīng)過轉(zhuǎn)染細胞檢測顯示,兩個Erβ沉默組PCR擴增片段的電泳條帶明顯較陰性對照組和空白對照組減弱,且ERβRNAi-1條帶比ERβRNAi

5、-2條帶的灰度比小,均有顯著性差異,P＜0.05。對Erβ沉默效果較好的ERβRNAi-1質(zhì)粒進行病毒包裝后,測得其病毒滴度T為106.67±025 IU/ml。繪制的生長曲線顯示ERβ RNAi組成骨細胞的增殖能力明顯高于空白對照組和陰性對照組。流式細胞儀檢測顯示ERβ RNAi組G1期細胞百分率明顯少于其它兩組,而S期和G2期細胞明顯百分率明顯高于其它兩組。RNAi組的ALP活性較其它兩組高;成骨結(jié)節(jié)較其它兩組的數(shù)量較多,體積較大。

6、Realtime-PCR檢測分析顯示,RNAi組OPG的Ct值較其它兩組小;RANKL的Ct值較其它兩組大。差異均有顯著性,P＜0.05。在雌性小鼠組中,ERβ RNAi組小鼠身長增加值高于空白對照組和陰性對照組;體重增加值卻小于其它兩組,有顯著性差異,P＜0.05。制作椎體組織切片,經(jīng)檢測顯示,ERβ RNAi組小鼠椎體骺板下的骨小梁較其它兩組密集,而骺板下軟骨增殖層較薄,而且椎體生長板軟骨層結(jié)構(gòu)紊亂;椎體骺板下紐胞凋亡數(shù)量較其它兩組

7、多;椎體骺板下細胞因子OPG陽性數(shù)量較其它兩組多;細胞因子RANKL陽性數(shù)量則較其它兩組少。差異均有顯著性,P＜0.05。在雄性小鼠組中,上述備項檢測結(jié)果均無顯著性差異,P＞0.05。
　　結(jié)論:構(gòu)建的ERβ RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠有效沉默ERβ的表達。在細胞和動物水平上,ERβ沉默后,成骨細胞的增殖能力增強,OPG表達增強,RANKL表達減弱,ALP活性增加,骨形成量增加。因此,我們可以反向推斷,ERβ的表達可能直接和/或間