應(yīng)用活體冷凍技術(shù)研究心外膜下微環(huán)境及不同血流動(dòng)力學(xué)條件下心肌細(xì)胞變化.pdf

1、前言:眾所周知,心血管微循環(huán)的異常和心肌細(xì)胞周圍微環(huán)境的改變是很多心血管疾病的一個(gè)重要特點(diǎn),活體動(dòng)物體內(nèi)的血漿成分是組成細(xì)胞組織微環(huán)境的重要成分之一,動(dòng)態(tài)變化的微環(huán)境可以相應(yīng)地反映細(xì)胞和組織的各種生理和病理狀態(tài)。然而,用傳統(tǒng)的組織制備方法,如浸泡固定方法,在其制備過(guò)程中因需要先將組織從活體動(dòng)物體內(nèi)切割下來(lái),導(dǎo)致了血液循環(huán)的喪失和組織缺血缺氧,而灌流固定方法,一方面因灌流使血管內(nèi)所有成分沖失,另一方面較高的灌流壓也可能會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白移位等

2、人工假象,此外,上述固定方法后的組織溶劑逐級(jí)脫水過(guò)程中還會(huì)引起組織皺縮的人工假象,因此很難從功能形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方面原位檢測(cè)活體動(dòng)物組織內(nèi)可溶性成分的定位。
　　 近十余年來(lái),一項(xiàng)新的用于活體動(dòng)物器官的組織制備方法,活體冷凍技術(shù)(IVCT),因其能克服上述傳統(tǒng)固定方法中存在的上述問(wèn)題而逐漸得到越來(lái)越多的關(guān)注。IVCT采用液體冷凍劑(-193℃),以104-105K/s的冷凍速度即刻將活體動(dòng)物的細(xì)胞和組織冷凍固定在原位,能保存

3、即刻的血流狀態(tài)和瞬間的分子結(jié)構(gòu)。在過(guò)去的數(shù)十年間,IVCT已經(jīng)被用于即刻冷凍活體動(dòng)物的任何靶器官,即刻捕獲瞬間發(fā)生的分子移動(dòng),原位保存各種細(xì)胞組織的細(xì)胞核內(nèi)可溶性成分,如活體小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)快速的磷酸化信號(hào),小鼠小腦內(nèi)可溶性細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)等。因此,IVCT能可靠的保存生物組織的超微結(jié)構(gòu)和各種成分,避免動(dòng)物死后因蛋白酶作用引起的組織降解以及血液循環(huán)缺失引起的改變。此外,應(yīng)用IVCT時(shí)組織細(xì)胞內(nèi)形成的細(xì)胞內(nèi)微小冰晶形成有孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有利于暴露細(xì)

4、胞核內(nèi)的抗原分子,通過(guò)增加抗體的滲透性增加了抗原性。IVCT之后無(wú)水固定劑(含2％多聚甲醛的丙酮溶液)的冷凍置換在將冷凍的組織細(xì)胞固定的同時(shí)在低溫下將冰晶置換出來(lái),避免了組織細(xì)胞內(nèi)水溶性成分的丟失和移位。因此,IVCT和之后的冷凍置換是一種能更精確檢測(cè)組織內(nèi)動(dòng)態(tài)改變的微循環(huán)和更可信的反映可溶性血漿蛋白定位的方法,因此也是檢測(cè)活體動(dòng)物心臟組織內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的微環(huán)境和微循環(huán)的理想選擇。
　　 在目前的研究中,我們應(yīng)用IVCT技術(shù)從功能形

5、態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方面檢測(cè)了活體小鼠心臟在生理和各種病理情況下心外膜下的血流、構(gòu)成心肌細(xì)胞周圍微環(huán)境的血漿蛋白的免疫定位、微血管滲透性、紅細(xì)胞變形性和T小管網(wǎng)的變化,闡述了心肌閏盤及T小管對(duì)血漿蛋白分子大小的選擇性,及外源性血漿蛋白BSA注射后的時(shí)間依賴性分布及其對(duì)內(nèi)源性蛋白分布的一過(guò)性影響。
　　 目的:
　　 對(duì)比傳統(tǒng)組織制備方法與活體冷凍技術(shù)(IVCT)在檢測(cè)小鼠心臟正常生理和病理狀態(tài)下心外膜下的血流、構(gòu)成心肌細(xì)胞

6、周圍微環(huán)境的血漿蛋白的免疫定位、微血管滲透性、紅細(xì)胞變形能力、閏盤和T小管網(wǎng)方面的異同,進(jìn)一步應(yīng)用IVCT技術(shù)檢測(cè)在各種病理?xiàng)l件下上述指標(biāo)的變化以及在外源性血漿蛋白BSA注射后,BSA的時(shí)間依賴性分布情況及其對(duì)內(nèi)源性血漿蛋白分布的一過(guò)性影響,為通過(guò)功能形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)來(lái)真實(shí)反映活體狀態(tài)下的心臟微循環(huán)和微環(huán)境提供新的研究方法和依據(jù)。
　　 方法:
　　 一、動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。昆明小鼠

7、,體重20-25克,雄性。每組4只小鼠。實(shí)驗(yàn)1共4組:IVCT組,浸泡固定組,灌流固定組,快速冷凍組。實(shí)驗(yàn)2共7組:生理鹽水(Saline)尾靜脈注射組,牛血清白蛋白(BSA:濃度為100mg/ml)尾靜脈注射5min組,30min組,4h組,8h組,48h組,以及BSA濃度4mg/ml尾靜脈注射4h組。每只小鼠的尾靜脈注射量為50μl。實(shí)驗(yàn)3共4組:正常生理狀態(tài)組(IVCT-N),腎上腹主動(dòng)脈結(jié)扎導(dǎo)致急性左室后負(fù)荷增高組(IVCT-L

8、AA),心臟左前降支結(jié)扎引起的急性心肌缺血組(IVCT-IC),過(guò)量麻醉劑引起心臟驟停組(IVCT-HA)。
　　 二、組織制備方法
　　 (一)IVCT與冷凍置換小鼠空腹12小時(shí),戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(100mg/kg體重)。之后用226的靜脈包埋針的塑料套管給小鼠做氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。開(kāi)胸暴露心臟,將預(yù)先在液態(tài)氮(-196℃)中預(yù)冷的異戊烷-丙烷制成的冷凍劑(-193℃)直接傾倒在小鼠跳動(dòng)的心臟組織

9、表面,然后迅速移到液態(tài)氮中。在液態(tài)氮中分離心臟組織,移到由干冰丙酮制冷的含2％多聚甲醛的純丙酮溶液中(-80℃)進(jìn)行冷凍置換48h,之后分別在-30℃,-10℃,4℃和室溫下各置換2h。純丙酮脫水3次,每次1小時(shí)。二甲苯透明,低溫石蠟(50℃-52℃)溫箱(60℃)過(guò)夜,混合蠟(56℃-58℃石蠟與低溫石蠟按3:1混合)孵育6h后包埋。
　　 (二)浸泡固定空腹12小時(shí)的小鼠如前麻醉后將心臟直接剪除迅速浸泡在2％多聚甲醛中過(guò)夜,

10、常規(guī)酒精逐級(jí)脫水,石蠟包埋(方法同前)。
　　 (三)灌流固定空腹小鼠常規(guī)麻醉后2％多聚甲醛(溶于0.1M磷酸緩沖液中,pH7.4)左心尖處灌流后剪下心臟浸泡在相同的固定劑中過(guò)夜,常規(guī)酒精逐級(jí)脫水,石蠟包埋(方法同前)。
　　 (四)切除心臟的快速冷凍空腹小鼠麻醉后迅速切除心臟,立刻浸泡到異戊烷-丙烷制成的冷凍劑中,之后用液態(tài)氮冷凍后,放入含2％多聚甲醛的純丙酮溶液中進(jìn)行冷凍置換和石蠟包埋(方法同前)。
　　 (

11、五)BSA尾靜脈注射生理鹽水或濃度為100mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)50μl尾靜脈注射。分別在BSA注射后的5min,30min,4h,8h,48h做IVCT組織制備方法。另外,濃度為4mg/ml的BSA在注射4h后進(jìn)行IVCT制備,注射劑量同前。
　　 (六)病理模型的制備
　　 1、正常對(duì)照組(IVCT-N):方法同1(IVCT與冷凍置換)。
　　 2、腎上腹主動(dòng)脈結(jié)扎致急性左室后負(fù)荷增高組(IVCT

12、-LAA):空腹小鼠常規(guī)麻醉,氣管插管機(jī)械通氣后,暴露腹腔,5-0手術(shù)線結(jié)扎腎上腹主動(dòng)脈10min。之后在小鼠心臟上執(zhí)行IVCT操作(方法同前)。
　　 3、左心室冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎致急性心肌缺血組(IVCT-IC):空腹小鼠常規(guī)麻醉,氣管插管機(jī)械通氣后,打開(kāi)胸腔,暴露心臟,8-0帶針手術(shù)線結(jié)扎左心室冠狀動(dòng)脈前降支10min后,進(jìn)行IVCT操作(方法同前)。
　　 4、麻醉劑過(guò)量致心臟驟停組(IVCT-HA):空腹小鼠常

13、規(guī)麻醉,氣管插管機(jī)械通氣后,打開(kāi)胸腔,暴露心臟,再給予大量麻醉劑腹腔注射致心臟驟停,進(jìn)行IVCT操作(方法同前)。
　　 三、組織學(xué)染色
　　 1、蘇木素-伊紅(HE)染色:3μm厚的石蠟切片常規(guī)去石蠟后做HE染色。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色:3μm厚的連續(xù)石蠟切片常規(guī)去石蠟后做血清白蛋白(Albumin),免疫球蛋白(IgG)或免疫球蛋白重鏈(IgG1),牛血清白蛋白(BSA),及連接蛋白-43(Connex

14、in43)染色。
　　 3、免疫熒光染色:3μm厚的石蠟切片常規(guī)去石蠟后分別做Albumin-IgG(或IgG1)、Albumin-Connexin43、IgG1-Connexin43、BSA-Connexin43雙重?zé)晒馊旧?br>　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究對(duì)四種不同組織制備方法獲得的HE染色的小鼠心臟組織切片上的紅細(xì)胞的數(shù)量,以及Albumin、BSA、IgG1或IgG的免疫定位的染色強(qiáng)度進(jìn)行了半定量分析。分別從四種不同

15、組織制備方法組,BSA尾靜脈注射組及其對(duì)照組隨機(jī)抽取HE染色或Albumin、BSA、IgG1或IgG免疫染色的心臟組織切片的顯微照片(500μm×200μm),每只鼠樣本10張。記錄每張HE染色顯微照片上的紅細(xì)胞數(shù)量。血管、間隙、閏盤、T小管和心肌細(xì)胞漿內(nèi)的免疫染色強(qiáng)度分為5級(jí):陰性(-),弱陽(yáng)性(±),陽(yáng)性(+),中強(qiáng)度陽(yáng)性(2+),強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。結(jié)果分別來(lái)自3名觀察者。我們還對(duì)IgG免疫染色的微血管用Chalkley方法進(jìn)行了微

16、血管容量的對(duì)比。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS-11.5軟件進(jìn)行非參數(shù)Kruskal-Wallis的H檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、不同組織制備方法的比較HE染色結(jié)果顯示,IVCT制備的小鼠心肌組織樣本的切片上,大量具有方向性的流動(dòng)狀態(tài)的降落傘型紅細(xì)胞保存在豐富的心肌細(xì)胞間的各級(jí)血管內(nèi),降落傘型紅細(xì)胞的頂端指向血流方向。橫跨心肌的心肌橋狀微血管、微血管分支和匯合處、以及分支和合流處微血管的血流方向清晰可

17、見(jiàn)。心肌細(xì)胞界限清晰,可見(jiàn)心肌細(xì)胞間的閏盤結(jié)構(gòu)。IM-DH制備的心肌組織樣本切片上,紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其形態(tài)為靜止?fàn)顟B(tài)的雙凹圓盤狀。各級(jí)血管塌陷,部分微血管內(nèi)的紅細(xì)胞缺失。心肌細(xì)胞腫脹,閏盤顯示不清。PF-DH制備的心肌組織樣本切片上,因灌流使紅細(xì)胞被沖走而缺如,血管擴(kuò)大,心肌細(xì)胞間的閏盤結(jié)未顯示。QF的心肌組織樣本與IVCT相似,但因組織切割引起的缺血缺氧和血液循環(huán)的喪失,部分紅細(xì)胞聚集。
　　 免疫染色結(jié)果顯示,IVCT制

18、備的小鼠心肌組織樣本切片上,Albumin分布在血管、間隙、閏盤和T小管處,而IgG或IgG1僅分布在血管和間隙處。IM-DH或PF-DH心肌組織樣本切片上,Albumin和IgG或IgG1的免疫定位不清晰,并且部分血漿蛋白移位或彌散到心肌細(xì)胞漿內(nèi)。
　　 二、內(nèi)源性和外源性血清蛋白的時(shí)間依賴性分布BSA注射5min后,BSA僅分布在血管內(nèi),30min后BSA與內(nèi)源性Albumin分布一致,分布在血管、間隙、閏盤和T小管,48h

19、后BSA僅分布在血管,逐漸從T小管、閏盤、間隙內(nèi)消失。BSA注射后隨時(shí)間延長(zhǎng)IgG1的免疫反應(yīng)強(qiáng)度增加。BSA注射4h后,在閏盤處IgG1的免疫反應(yīng)顯示陽(yáng)性,而B(niǎo)SA注射8h后,這一免疫陽(yáng)性反應(yīng)消失。
　　 為了明確BSA注射4h后IgG1進(jìn)入閏盤是否與BSA的濃度相關(guān),我們進(jìn)行了不同濃度BSA注射4h后的免疫檢測(cè)。結(jié)果顯示,濃度為4mg/ml的BSA注射4h后,BSA和IgG1僅免疫定位在血管和間隙,而濃度為100mg/m的B

20、SA注射4h后,BSA和IgG1除了免疫定位在血管和間隙外,均進(jìn)入閏盤和T小管。
　　 三、不同病理?xiàng)l件下的形態(tài)學(xué)改變和血漿蛋白定位在均應(yīng)用IVCT制作的小鼠心肌組織樣本的切片上,與生理狀態(tài)相比,急性左室后負(fù)荷增高(IVCT-LAA)的心肌組織切片顯示,T小管紊亂,相距變窄,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯示不清。而急性心肌缺血(IVCT-IC)的心肌組織切片顯示,T小管紊亂,間距變寬,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯示不清,部分血漿蛋白漏出彌散到心肌細(xì)胞漿內(nèi)。心臟驟停(

21、IVCT-HA)的心肌組織切片上,無(wú)血漿蛋白的漏出移位,T小管結(jié)構(gòu)顯示不清。
　　 結(jié)論:
　　 1、IVCT技術(shù)能顯示活體小鼠心肌組織的微循環(huán)血流狀態(tài)、可溶性的微環(huán)境成分的變化和超微組織結(jié)構(gòu)的功能形態(tài)學(xué)。
　　 2、生理狀態(tài)下,血漿白蛋白可分布在心肌細(xì)胞間的閏盤處和心肌細(xì)胞表面的T小管內(nèi),是構(gòu)成心肌細(xì)胞周圍微環(huán)境的成分之一。
　　 3、閏盤和T小管對(duì)血漿蛋白具有分子大小選擇性。
　　 4、高濃度