脂肪干細(xì)胞聯(lián)合褪黑激素對犬坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的臨床實(shí)踐.pdf

1、隨著生活水平的提高，飼養(yǎng)名貴犬的家庭越來越多。然而，外傷、骨折、腫瘤等均可引起犬坐骨神經(jīng)損傷，并且缺損后的神經(jīng)生長速度慢、效應(yīng)器和感受器萎縮快，因此周圍神經(jīng)損傷后的再生和修復(fù)就成為獸醫(yī)臨床的研究熱點(diǎn)。近年來，組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展為周圍神經(jīng)的修復(fù)帶來了新的希望，其中理想的種子細(xì)胞的獲得是構(gòu)建組織工程神經(jīng)的前提和基礎(chǔ)。脂肪源性干細(xì)胞（ Adipose stem cells，ADSCs）是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可以向雪旺

2、細(xì)胞（Schwann cells，SCs）分化，同時(shí)，ADSCs還具有來源廣泛、取材簡便、并發(fā)癥少、增殖速度快、擴(kuò)增穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為種子細(xì)胞來修復(fù)損傷的外周神經(jīng)。但是損傷組織處的微環(huán)境含氧量和 PH值均較易造成移植的干細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，ADSCs在體內(nèi)有效的增殖是提高其修復(fù)能力的關(guān)鍵。褪黑激素（Melatonin，MT）是松果體內(nèi)合成的一種吲哚類激素，參與調(diào)控機(jī)體的晝夜節(jié)律、改善睡眠質(zhì)量，具有抑制腫瘤生長、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等廣

3、泛的生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)MT對干細(xì)胞增殖和分化具有重要的調(diào)控作用。由此，本實(shí)驗(yàn)首先研究了 MT對犬 ADSCs增殖的影響，隨后將 MT孵育的 ADSCs復(fù)合神經(jīng)支架移植入犬坐骨神經(jīng)缺損處，3個(gè)月后檢測了犬坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)效果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分。
　?。?）犬ADSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　無菌條件下取出犬兩側(cè)腹股溝脂肪，采用Ⅰ型膠原酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。通過脂向和骨向分化以

4、及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 Marker對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞中逐漸出現(xiàn)脂滴，油紅O染色為紅色。成骨誘導(dǎo)后ADSCs形成典型的黑色鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈現(xiàn)紅色；流式檢測結(jié)果顯示：CD29和 CD90呈陽性表達(dá)， CD45和CD80呈陰性。以上結(jié)果證實(shí)，分離到的細(xì)胞為犬ADSCs。
　?。?）MT對ADSCs增殖的影響
　　0，10 nM，50 nM，100 nM，1000 nM，10000 nM MT分

5、別作用于犬ADSCs48 h后，通過MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率。分別用10μM MT受體（Mel la/Mel lb）非特異受體阻斷劑（Luzindole）和0.1μM Mellb特異性阻斷劑（4P-PDOT）和50μM絲裂原激活蛋白激酶阻斷劑（PD98059）作用犬ADSCs30 min后，再加入50 nM MT孵育48 h，應(yīng)用MTT法檢測MT受體阻斷劑和ERK通路阻斷劑對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示，50 nM和100 nM MT

6、組ADSCs的增殖率分別為123.27±2.71%和120.5±1.94%，比對照組顯著提高了23.27%和20.5%（P＜0.05）。高于1000 nM濃度的MT則對細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。50 nM的 MT促 ADSCs增殖效果最顯著。Luzindole和 PD98059孵育細(xì)胞后，犬ADSCs增殖率顯著降低（P＜0.05）。4P-PDOT孵育細(xì)胞后增殖率沒有顯著變化。由此表明，MT通過其受體（Mel la），經(jīng)Ras-Raf-

7、MEK-ERK途徑促進(jìn)ADSCs的增殖，但是具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
　　（3）ADSCs聯(lián)合MT對犬坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的評價(jià)
　　建立犬10 mm坐骨神經(jīng)缺損模型。實(shí)驗(yàn)共分成3組，未復(fù)合細(xì)胞的支架材料組作為 A組，ADSCs與膠原凝膠復(fù)合并注入支架材料中制備成組織工程神經(jīng)移植物作為B組，ADSCs與50 nM MT復(fù)合支架材料制備的組織工程神經(jīng)移植物作為 C組，每組3條犬，分別將各組組織工程神經(jīng)通過外科手術(shù)移植入坐骨神經(jīng)缺損

8、處。3個(gè)月后通過 HRP逆行示蹤，電鏡觀察，組織學(xué)染色、電生理等方法進(jìn)行神經(jīng)再生評價(jià)。結(jié)果顯示，與A組和B組相比，ADSCs與MT聯(lián)合后可見較多的 HRP陽性神經(jīng)元；再生神經(jīng)纖維數(shù)目較多，神經(jīng)纖維粗大，排列整齊，髓鞘較厚；有髓神經(jīng)纖維平均面積和密度明顯大于其他兩組；再生神經(jīng)動作電位振幅及傳導(dǎo)速度顯著高于A組和B組。
　　綜上所述：MT能夠促進(jìn)犬ADSCs的增殖，且該作用可能是MT通過MT1受體激活 ERK信號通路來發(fā)揮作用，但是，