不同佐劑下幽門螺桿菌UreB疫苗的Th表位優(yōu)勢應(yīng)答研究.pdf

1、背景:
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是定植于人胃粘膜及十二指腸粘膜局部的革蘭陰性桿菌。全球范圍感染率超過50％,與慢性胃炎,消化性潰瘍及胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤密切相關(guān),已被世界衛(wèi)生組織列為人類的一類致病因子。目前臨床上主要通過聯(lián)用多種抗生素與質(zhì)子泵抑制劑對Hp感染患者進(jìn)行治療。但由此產(chǎn)生的抗生素耐藥問題越來越突出,同時(shí)還存在患者依從性差及再次感染率高等問題,因此研發(fā)新的抗菌疫苗以預(yù)防或清除局部H

2、p已十分必要。
　　目前針對Hp所設(shè)計(jì)的全菌疫苗,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性應(yīng)答,但因其抗原成分復(fù)雜常導(dǎo)致較多的副反應(yīng)發(fā)生。而通過重組表達(dá)某一抗原成分設(shè)計(jì)的亞單位疫苗不僅可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),而且安全性更高。然而在疫苗研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn),同一蛋白抗原分別采用不同佐劑或同一佐劑的不同免疫途徑進(jìn)行疫苗接種后,往往出現(xiàn)截然不同的免疫保護(hù)效果。Hp為一種胞外感染菌,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,已經(jīng)證實(shí)特異性CD4+T細(xì)

3、胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗Hp感染過程中發(fā)揮重要的免疫保護(hù)作用。而抗原所激發(fā)的特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答主要由抗原中的某一個(gè)或幾個(gè)表位所誘導(dǎo)。因此我們推測基于同一保護(hù)性抗原的亞單位疫苗,輔以不同的佐劑或同一佐劑的不同免疫途徑,所產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果差異可能由于特異性CD4+T細(xì)胞對應(yīng)顯性表位應(yīng)答的不同所造成。
　　Hp尿素酶被證實(shí)與Hp的感染、定植密切相關(guān),其通過分解尿素產(chǎn)氨以中和胃粘膜局部的H+,產(chǎn)生適于Hp定植的微環(huán)境。尿素酶包含兩個(gè)亞基

4、即A亞單位(UreA)和B亞單位(UreB)。其中UreB可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,且核苷酸和氨基酸序列高度保守是目前公認(rèn)的Hp保護(hù)性抗原。因此本課題選取UreB作為研究對象,分別輔以弗氏佐劑、CpG和AddaVax三種不同佐劑進(jìn)行皮下免疫接種,以及CpG佐劑的皮下和滴鼻兩種途徑免疫小鼠,采用步移合成重疊肽方法和細(xì)胞內(nèi)因子染色、流式細(xì)胞術(shù)等對特異性CD4+T細(xì)胞的顯性表位應(yīng)答特性進(jìn)行分析。探尋不同佐劑或免疫途徑下表位特異性優(yōu)勢應(yīng)答的

5、差異,揭示不同佐劑或免疫途徑下免疫保護(hù)作用差異的內(nèi)在原因。
　　目的:
　　以UreB為研究對象,通過對特異性CD4+T細(xì)胞的顯性表位優(yōu)勢應(yīng)答特性分析為同一保護(hù)性抗原的不同佐劑疫苗或同一佐劑疫苗的不同免疫途徑所產(chǎn)生的保護(hù)效果差異提出新的解析,為基于表位設(shè)計(jì)的Hp疫苗研究提供候選分子和實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為Hp疫苗的保護(hù)性應(yīng)答監(jiān)測提供有效方法。
　　方法:
　　1、幽門螺桿菌培養(yǎng)。
　　選擇在BALB/c小鼠模型中定

6、植量較高的幽門螺桿菌菌株B6進(jìn)行培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)菌濃度為109CFU/ml用于感染攻毒。
　　2、小鼠免疫攻毒。
　　分別采用CpG,AddaVax,弗氏佐劑聯(lián)合UreB抗原皮下注射免疫小鼠。CpG分別采用皮下和滴鼻進(jìn)行免疫。表位免疫均采用滴鼻免疫,佐劑選擇CpG。末次免疫后1周行Hp攻毒。
　　3、特異性抗體檢測。
　　采用ELISA法分別檢測血清和胃粘膜局部的IgG抗體和IgA抗體。判斷其體液免疫應(yīng)答情況。

7、>　　4、胃粘膜Hp定植量檢測
　　末次攻毒后4周,提取小鼠胃粘膜局部DNA,采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測幽門螺桿菌16SrDNA。判斷胃粘膜局部Hp定植情況。
　　5、特異性T細(xì)胞擴(kuò)增。
　　收集免疫后小鼠的脾臟,研磨成單細(xì)胞懸液,經(jīng)小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離,收集單個(gè)核細(xì)胞,在白介素存在的條件下體外經(jīng)抗原或肽刺激進(jìn)行特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。
　　6、誘導(dǎo)小鼠骨髓源DCs與遞呈實(shí)驗(yàn)。
　　收集小鼠骨髓,制成單細(xì)胞懸液后

8、裂解紅細(xì)胞,剩余細(xì)胞在相應(yīng)細(xì)胞因子的刺激下分化發(fā)育為DCs。成熟的DCs預(yù)負(fù)載抗原1h后與特異性細(xì)胞共培養(yǎng),用于遞呈實(shí)驗(yàn)。
　　7、細(xì)胞內(nèi)因子染色。
　　在高爾基體阻斷劑存在的條件下,采用合適的刺激物刺激特異性細(xì)胞合成細(xì)胞因子5h,之后用熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞表面分子及細(xì)胞內(nèi)因子。最后進(jìn)行流式分析。
　　8、數(shù)據(jù)分析。
　　胃粘膜局部Hp定植量檢測采用非配對T檢驗(yàn)。其它數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)

9、準(zhǔn)差表示。p≤0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、UreB聯(lián)合不同佐劑免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生有差異的免疫保護(hù)作用。CpG疫苗滴鼻組和弗氏佐劑疫苗皮下注射組小鼠胃粘膜幽門螺桿菌定植量較其它免疫組和PBS對照組顯著降低(P<0.01),而其它免疫組與PBS對照組相比無顯著差異,但CpG疫苗皮下組、AddaVax疫苗皮下組的Hp定植數(shù)量略低于PBS對照組。
　　2、體外從抗原免疫組小鼠脾臟中成功擴(kuò)增出抗原特異性CD4

10、+T細(xì)胞,其比例可達(dá)到10%,而未免疫組即PBS對照組未見陽性信號。
　　3、從UreB抗原中篩選到4個(gè)優(yōu)勢應(yīng)答表位,AddaVax佐劑皮下免疫組優(yōu)勢應(yīng)答表位為UreB485-497(AKYDANITFVSQA),而弗氏佐劑及CpG佐劑皮下免疫組均可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對UreB317-329(MLMVCHHLDKSIK)和UreB409-421(YTINPAIAHGISE)的表位特異性細(xì)胞應(yīng)答,CpG佐劑滴鼻免疫組優(yōu)勢應(yīng)答表位為UreB3

11、73-390(ITRTWQTADKNKKEFGRL)。
　　4、顯性表位UreB317-329(MLMVCHHLDKSIK)、UreB373-385(ITRTWQTADKNKK)、UreB409-421(YTINPAIAHGISE)和UreB485-497(AKYDANITFVSQA)的應(yīng)答均可被MHC-Ⅱ(I-A)單克隆抗體特異性阻斷。
　　5、對顯性表位進(jìn)行免疫保護(hù)性評估發(fā)現(xiàn)UreB317-329(MLMVCHHLDKS

12、IK)、UreB373-385(ITRTWQTADKNKK)表位免疫組胃粘膜Hp定植量顯著降低(P<0.001),而表位UreB409-421(YTINPAIAHGISE)和UreB485-497(AKYDANITFVSQA)免疫組與PBS對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1、針對同一保護(hù)性抗原應(yīng)用不同的佐劑可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生不同的表位特異性CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢應(yīng)答。
　　2、針對同一保護(hù)性抗原,同一佐劑的不同免疫途

13、徑可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生不同的表位特異性CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢應(yīng)答。
　　3、采用步移合成重疊肽法,從UreB中篩選鑒定出4個(gè)新的Th顯性表位UreB317-329(MLMVCHHLDKSIK)、UreB373-385(ITRTWQTADKNKK)、UreB409-421(YTINPAIAHGISE)和UreB485-497(AKYDANITFVSQA),可通過MHC-Ⅱ(I-A)限制性自然遞呈,并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞優(yōu)勢應(yīng)答。
　　4、四個(gè)