治療性幽門螺桿菌表位疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的主要病原菌，與胃癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤密切相關(guān)，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子。目前臨床治療H.pylori感染主要方法為聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素的療法，雖然在一定程度上能清除H.pylori，但患者對(duì)藥物的依從性差、抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)、再感染的發(fā)生及藥物的不良反應(yīng)等，這都使臨床藥物治療受到限制。有效的預(yù)防性和治療性H.p

2、ylori疫苗可以克服上述藥物治療H.pylori的不足，被認(rèn)為是控制H.pylori感染的最有前景的方法，是根除H.pylori感染的希望。 基于表位疫苗設(shè)計(jì)(Epitope-based Vaccine Design，EBVD)的策略被認(rèn)為是第四代疫苗，其著眼點(diǎn)是免疫應(yīng)答的功能單位——表位。表位疫苗明顯的優(yōu)勢是設(shè)計(jì)靈活、針對(duì)性強(qiáng)，選擇優(yōu)勢表位進(jìn)行合理的組合設(shè)計(jì)，能夠誘導(dǎo)高效、安全、特異的免疫應(yīng)答。近年來，表位疫苗已經(jīng)成為研制感

3、染性疾病、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗設(shè)計(jì)的新方向，并取得顯著進(jìn)展。H．pylori自然感染可通過免疫偏差、免疫顛覆和免疫缺陷等機(jī)制逃避機(jī)體的清除，進(jìn)而引起機(jī)體對(duì)H．pylori自身天然蛋白成分的免疫耐受，研究表明僅僅選用H．pylori天然抗原進(jìn)行免疫治療是很難打破機(jī)體免疫耐受，激發(fā)有效的免疫應(yīng)答，因此，必須對(duì)天然抗原分子進(jìn)行設(shè)計(jì)、修飾和改造。蛋白抗原發(fā)揮其功能主要通過表位來體現(xiàn)特異性，這些表位不僅包括B細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位、C

4、TL表位等與免疫識(shí)別相關(guān)的結(jié)構(gòu)，而且還同時(shí)存在毒性或抑制性表位等不利于免疫保護(hù)的因素。為了提高蛋白抗原的保護(hù)性，就必須在表位水平上作出選擇和設(shè)計(jì)以得到理想的疫苗分子。借鑒其它疾病表位疫苗的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)，選擇H．pylori優(yōu)勢抗原的保護(hù)性、特異性、免疫原性強(qiáng)的表位進(jìn)行設(shè)計(jì)，輔以粘膜佐劑來激發(fā)更強(qiáng)、更特異的、不同于自然感染時(shí)的粘膜免疫應(yīng)答，有可能打破免疫耐受，達(dá)到預(yù)防或治療H．pylori感染的目的。 H．pylori感染免疫治療后的

5、保護(hù)機(jī)制較為復(fù)雜，所設(shè)計(jì)的不同類型H．pylori治療疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)制也存在差異。在細(xì)胞免疫方面，已有很好的證據(jù)證實(shí)：CD4<'+>T細(xì)胞對(duì)于H．pylori的免疫保護(hù)是必需的，并且，隨著對(duì)H．pylori疫苗治療效果及機(jī)制研究的深入，逐漸認(rèn)識(shí)到機(jī)體抵抗H．pylori感染的保護(hù)性機(jī)制可能為一種Th1/Th2同時(shí)存在的平衡應(yīng)答模式；在體液免疫方面，不能完全排除特異性體液免疫應(yīng)答的作用，基于對(duì)H．pylori感染免疫機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和本

6、室先前H．pylori感染治療的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，H．pylori治療性疫苗的設(shè)計(jì)可能遵循以CD4<'+>T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1/Th2平衡應(yīng)答為主，兼顧特異性體液免疫的基本策略。 在H．Pyfori的已知蛋白抗原中，尿素酶B亞單位(UreB)和粘附素(HpaA)是已經(jīng)證實(shí)具有很強(qiáng)的抗原性和免疫保護(hù)力的抗原。本課題在本室成功篩選和鑒定UreB多個(gè)Th細(xì)胞表位的基礎(chǔ)上，選用UreB三個(gè)優(yōu)勢性Th細(xì)胞表位(兩個(gè)Th2，一個(gè)Th1表位)和文獻(xiàn)

7、報(bào)道UreB的一個(gè)B細(xì)胞表位、HpaA的一個(gè)B細(xì)胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和分析對(duì)天然抗原表位進(jìn)行分子設(shè)計(jì)、重組、優(yōu)化、計(jì)算機(jī)分子結(jié)構(gòu)模建等獲得理論上最佳組合方式，按此組合方式構(gòu)建了表達(dá)H．Pylori五個(gè)表位多肽基IN(Huepi)與ltB基因的表位疫苗融合蛋白，經(jīng)抗原特性及各表位功能分析后，進(jìn)行口服免疫治療小鼠H．Pylori感染的試驗(yàn)，觀察H．Pylori清除效果及相應(yīng)的免疫應(yīng)答過程，為H．Pylori治療性疫

8、苗的設(shè)計(jì)與完善奠定基礎(chǔ)。本課題的主要研究方法、結(jié)果與結(jié)論如下： 1．治療性幽門螺桿菌表位疫苗的設(shè)計(jì) 選用ureB三個(gè)優(yōu)勢性Th細(xì)胞表位(兩個(gè)Th2，一個(gè)Th1表位)和文獻(xiàn)報(bào)道UreB的一個(gè)B細(xì)胞表位、HpaA的一個(gè)B細(xì)胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB，利用RANKPEP軟件、DNAstar軟件進(jìn)行表位組合順序分析和串聯(lián)表位與分子內(nèi)佐劑LTB之間連接linker的設(shè)計(jì)，獲得理論上最佳組合方式，采用Robetta、Modeller

9、和SPDB viewer軟件進(jìn)行表位融合蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的模建，獲得理論上最接近天然狀態(tài)下的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 2．治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原的構(gòu)建、表達(dá)、純化 按照第一部分的設(shè)計(jì)，在本室成功構(gòu)建表位融合蛋白Uepi的基礎(chǔ)上，分別克隆了表位多肽基因Huepi和，ltB基因，采用重疊延伸PCR的方法將兩段基因按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方向通過linker連接起來，獲得表位多肽與ItB的融合基因(Huepi-ltB)，通過限制性內(nèi)切酶Nc

10、oⅠ、XhoⅠ分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-Huepi-ltB、pET22b-Huepi和原核表達(dá)工程菌株pET22b-Huepi-ltB/BL21、pET22b-Huepi/BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)分子量分別為20.7 kDa(Huepi-LTB)和8.3 kDa(Huepi)的表位融合蛋白，分別采用不同的純化方案對(duì)重組表位融合蛋白Huepi-LTB和Huepi進(jìn)行純化與鑒定，純化后Huepi-LTB和Huepi的蛋白純度

11、分別為95.2％和97.6％。 3．治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原特性及各表位功能分析 表位疫苗融合蛋白分別免疫家兔制備兔抗Huepi-LTB和Huepi抗血清，采用Western blot和ELIsA檢測表位疫苗融合蛋白特異性抗體與rUreB和rHpaA的免疫反應(yīng)性及LTB組分GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合活性；通過尿素酶抑制實(shí)驗(yàn)、H.Pylori與胃上皮細(xì)胞(GES-1)的粘附與粘附抑制實(shí)驗(yàn)，血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測B細(xì)

12、胞表位的作用；表位融合蛋白注射免疫小鼠，通過特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測Th細(xì)胞表位作用。結(jié)果表明：表位疫苗融合蛋白產(chǎn)生的特異性抗體能夠與rureB、rHpaA、rLTB反應(yīng)，且融合蛋白中LTB組分保持了與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合活性；抗表位融合蛋白的特異性抗體在一定程度上能夠抑制H．Pylori尿素酶的活性，并可阻止H．Pylori與胃上皮細(xì)胞的粘附和抑制H．Pylori與紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)；淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)三個(gè)Th表位肽能刺激表位疫苗免

13、疫小鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性增殖(SI>2)，并且表位疫苗致敏的淋巴細(xì)胞在rUreB的刺激下可以增殖。實(shí)驗(yàn)證明表位融合蛋白具有良好的免疫原性、免疫反應(yīng)性并且所包含的各表位發(fā)揮了各自的免疫效應(yīng)。 4．治療性幽門螺桿菌表位疫苗免疫治療BALB/c小鼠H．Pylori感染效果評(píng)價(jià)及機(jī)制探討 1)表位疫苗治療BALB/c小鼠H．Pylori感染效果評(píng)價(jià)：采用H．Pylori動(dòng)物適應(yīng)菌株SS1感染BALB/c小鼠，成功建立H．Pyl

14、ori感染動(dòng)物模型，同時(shí)建立H．Pylori定量培養(yǎng)方法，根據(jù)H.pylori 16s rRNA編碼基因設(shè)計(jì)引物建立H．Pylori感染的PCR檢測方法。以表位融合蛋白Huepi-LTB和Huepi+rLTB每間隔7～10d，連續(xù)4次對(duì)感染H.pylori的BALB/c小鼠進(jìn)行口服免疫治療，于治療38d后進(jìn)行H.pylori定量培養(yǎng)檢測、尿素酶實(shí)驗(yàn)、PCR檢測評(píng)價(jià)表位疫苗的治療效果。結(jié)果顯示表位融合蛋白能夠顯著降低小鼠胃粘膜H.pylo

15、ri的定植數(shù)量，清除率分別為64.2％和61.5％。 2)表位疫苗治療BALB/c小鼠H.pylori感染保護(hù)機(jī)制探討： H.Pylori感染小鼠予以表位疫苗口服免疫治療38d后，流式細(xì)胞術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞亞群變化，淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測脾和腸粘膜淋巴細(xì)胞的特異性增殖，ELISA檢測脾和粘膜淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌，RT-PCR檢測脾和腸粘膜淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γmRNA表達(dá)水平，ELISA檢測特異性抗體IgG、IgA的

16、產(chǎn)生。 結(jié)果顯示：H.pylori超聲上清可顯著刺激表位疫苗免疫治療小鼠脾淋巴細(xì)胞和腸粘膜淋巴細(xì)胞特異性增殖，與PBS組、佐劑組和單純表位蛋白組差異顯著(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞亞群顯示CD4<'+>T淋巴細(xì)胞增殖明顯；疫苗作用下脾淋巴細(xì)胞和腸粘膜淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，RT-PCR結(jié)果顯示脾和腸粘膜淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平明顯增高；體液免疫應(yīng)答