幽門螺桿菌分子內(nèi)佐劑多亞單位融合疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種定植于人類胃粘膜的革蘭氏染色陰性、螺桿狀、微需氧菌；在全世界范圍內(nèi)廣泛感染，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。Hp的抗感染治療存在較大問題，使用單劑藥物根除率低，而使用多聯(lián)藥物費(fèi)用昂貴，治愈率不高且不能有效阻止Hp的再感染和復(fù)發(fā)，此外，耐藥菌株的增加也使抗Hp治療面臨越來越復(fù)雜的難題，因此研制Hp疫苗和其有效接種可能是預(yù)防Hp感染最有前景的手段。 本研究依托實(shí)驗(yàn)室長期研究Hp疫

2、苗的結(jié)果，擬在已完成的Hp三亞單位融合蛋白HspA-HpaA-UreB414(rHHU)的基礎(chǔ)上，將該基因片段hhu與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位基因ltB構(gòu)建融合基因；并通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到帶分子內(nèi)佐劑LTB的多亞單位蛋白疫苗；純化目的蛋白后對(duì)沙鼠進(jìn)行免疫后攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)該疫苗的免疫保護(hù)效率，并與其它疫苗方案的保護(hù)效果進(jìn)行比較，為新型分子內(nèi)佐劑多亞單位Hp疫苗的研制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)完成了以下幾個(gè)方面的工作：

3、 1.采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增目的基因片段hhu和ltB；PCR重疊延伸拼接法將ltB基因融合于hhu基因的頭部，構(gòu)建lhhu融合基因形式；NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切后將融合基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中；經(jīng)酶切、測序鑒定后，陽性重組子分別轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109(DH3)。 2.工程菌分別在25℃、37℃及42℃條件經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；SDS-PAGE，兔抗LTB、兔抗Hp

4、血清和小鼠抗His6單抗免疫印跡檢測，證實(shí)重組融合蛋白rLHHU在不同溫度條件及不同宿主菌環(huán)境中均表達(dá)為兩條分子量接近的蛋白帶，顯示目的蛋白發(fā)生了降解。 3.重新構(gòu)建融合基因hhul形式，將ltB融合于hhu的尾部，并在兩片段間引入8氨基酸柔性linkerGGGSGGGS；融合基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中獲得表達(dá)質(zhì)粒phhul；經(jīng)酶切、測序鑒定后，陽性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)；IPTG誘導(dǎo)工

5、程菌表達(dá)，SDS-PAGE及免疫印跡檢測，證實(shí)為目的蛋白的表達(dá)，分子量約為55.2KD；UVP掃描證實(shí)融合蛋白表達(dá)約占總蛋白的20％。 4.重組蛋白rHHUL提交PridictProtein(http：//cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/)預(yù)測目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；提交Swiss-model(http：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析；結(jié)果分析重組融

6、合蛋白rHHUL含有16個(gè)α螺旋和19個(gè)β片層結(jié)構(gòu)。利用DNAstar軟件評(píng)價(jià)蛋白linker柔韌性、親水性、表面概率等特性。 5.小量工程菌經(jīng)超聲破碎后鑒定融合蛋白的表達(dá)形式為包含體；利用Anthe_5.0軟件分析蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及相對(duì)分子量；通過包含體洗滌，純化條件摸索，確定了鎳離子親和層析的方法及純化條件，利用AKTA純化儀純化目的蛋白，得到純度＞80％的融合蛋白。 6.純化后融合蛋白保持了各亞單位組分及佐劑獨(dú)立的免疫

7、反應(yīng)性；與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重組蛋白中LTB組分具有能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性。 7.融合蛋白口服免疫沙鼠的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)：將56只蒙古沙鼠隨機(jī)分為4組：分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(rHHUL)、無分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(rHHU)、融合蛋白與佐劑物理混合組(rHHU+LTB)和PBS對(duì)照組。分別于0、7、14、28天口服免疫接種，劑量為150μg/只/次。末次免疫后10天口服109CFUHp動(dòng)物適應(yīng)株。攻毒30天后剖

8、殺動(dòng)物取樣，ELISA檢測免疫后血清特異IgG，通過Hp培養(yǎng)、快速尿素酶試驗(yàn)及特異性PCR檢測沙鼠胃部標(biāo)本并計(jì)算免疫后各組攻毒保護(hù)率。結(jié)果顯示：分子內(nèi)佐劑的融合蛋白組血清特異IgG水平與PBS組相比，升高明顯，差異極顯著(p＜0.001)，與無分子內(nèi)佐劑融合蛋白組IgG水平也有顯著性差異(p＜0.001)，與融合蛋白和佐劑物理混合組相比，差異不顯著(p＞0.05)。動(dòng)物攻毒保護(hù)率為91.5％。 綜上所述，研制開發(fā)新型有效的Hp疫