熊膽粉及其主要成分熊去氧膽酸影響肝癌的研究.pdf

1、世界范圍內(nèi)，原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）在所有惡性腫瘤中，發(fā)病率第5位，死亡率第3位，其中半數(shù)以上發(fā)生于中國。肝癌通常發(fā)生于慢性肝病、肝硬化的基礎(chǔ)上，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期肝癌，雖然治療方法眾多，但總體療效不佳，亟需尋找更好的防治策略。一方面應(yīng)高度重視乙肝疫苗接種等干預(yù)措施從根源上阻斷肝癌，另一方面應(yīng)積極開拓更好的治療方法和源頭創(chuàng)新藥物。近年來中醫(yī)藥防治肝癌受到重視，因其整體觀更強(qiáng)并能兼顧治療基礎(chǔ)性慢性肝病，提高患者的整體機(jī)能、改善生

2、存質(zhì)量、延長帶瘤生存時間。
　　 熊膽是傳統(tǒng)名貴中藥，因?yàn)楸８巍⒗懐熜э@著，臨床廣泛應(yīng)用于治療各種慢性肝病，其主要成分熊去氧膽酸(UDCA)是FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于治療慢性膽汁性肝硬化的唯一藥物。雖偶有報(bào)道熊膽及其膽汁酸成分作用于腫瘤的研究，但大多停簾于體外水平，應(yīng)用熊膽集中于肝癌防治并深入體內(nèi)水平和臨床患者的研究和探討鮮見報(bào)道，因此有必要對于熊膽防治肝癌的作用做進(jìn)一步的探索，為開發(fā)熊膽及其相關(guān)制劑用于防治肝癌提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。<

3、br>　　 第一部分高效液相色譜測定熊膽粉主要成分熊去氧膽酸的含量
　　 目的:建立熊膽粉中UDCA含量的測定方法。
　　 方法:采用高效液相色譜法測定熊膽粉中UDCA的含量。色譜柱為WatersSymmketry C18(4.6×150mm，5μm);以乙腈-磷酸溶液(0.025mol/L)(28∶72)為流動相，調(diào)節(jié)pH值為3.0;檢測波長為210nm;流動速度為1ml/min;柱溫為室溫。
　　 結(jié)果:熊

4、膽粉中各成分分離良好，進(jìn)樣量在10～30μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，r=0.9998。本批次熊膽粉?；切苋パ跄懰岷繛?1.77％，換算后得到熊去氧膽酸含量為24.96％。
　　 結(jié)論:高效液相色譜測定熊膽粉中UDCA含量的方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，實(shí)驗(yàn)操作簡單、快速、準(zhǔn)確。
　　 第二部分熊膽粉和熊去氧膽酸對人肝癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用
　　 目的:通過體外試驗(yàn)，初步考察熊膽及其主要成分熊去氧膽酸對肝癌細(xì)

5、胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用及其機(jī)理。
　　 方法:以人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721為研究模型，熊膽粉、UDCA干預(yù);利用倒置顯微鏡、MTT、熒光染色觀察、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot，分別觀察和檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:熊膽粉、UDCA顯著抑制HepG2、SMMC-7721，具有量效和時效關(guān)系，能夠誘導(dǎo)凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，提升Bax和降低B

6、cl-2表達(dá)。當(dāng)含有等量UDCA時，熊膽粉各組對于肝癌細(xì)胞的抑制率要高于UDCA各組，在凋亡率和Bax/Bcl-2比值方面，熊膽組明顯提高，p＜0.05。
　　 結(jié)論:熊膽粉、UDCA可能通過阻滯細(xì)胞增殖周期和調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2表達(dá)，抑制人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721增殖并以線粒體通路誘導(dǎo)凋亡。除了UDCA，熊膽的其他成分也發(fā)揮了一定的抗肝癌作用。
　　 第三部分熊膽粉和熊去氧膽酸對小鼠移植性皮下肝癌的抑制

7、及其機(jī)制
　　 目的:通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討熊膽及其主要成分熊去氧膽酸對肝癌的抑瘤作用及其機(jī)理。
　　 方法:建立小鼠H22移植性皮下肝癌模型，隨機(jī)分為單純模型組、環(huán)磷酰胺組及熊膽粉和UDCA分別高低劑量兩組。觀察體重等一般情況，計(jì)算抑瘤率，HE染色鏡檢，免疫組化檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，Western blot檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生成因子(VEGF)和p53蛋白表達(dá)水平，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，ELISA法檢測血清白

8、介素-2(IL-2)水平。
　　 結(jié)果:熊膽粉和UDCA各組的抑瘤率分別達(dá)到39.68％、25.29％、21.40％、11.47％，呈現(xiàn)量效關(guān)系，HE染色鏡檢和PCNA表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)了較好的抗肝癌療效。熊膽粉兩組、UDCA高劑量組均顯著下調(diào)了VEGF的表達(dá)水平，熊膽粉兩組顯著上調(diào)了野生型p53蛋白水平。與模型組比較，熊膽粉和 UDCA各組的體重?zé)o明顯下降、免疫功能指標(biāo)得到提升，尤其熊膽高劑量組脾指數(shù)顯著提升;與環(huán)磷酰胺組比較

9、，熊膽粉和UDCA各組的體重和免疫功能均顯著提升，p＜0.05。當(dāng)含有等量UDCA時，熊膽粉與熊去氧膽酸各組分別對應(yīng)比較，抑瘤率明顯升高，PCNA水平明顯降低，顯著上調(diào)p53表達(dá)水平，p＜0.05。
　　 結(jié)論:熊膽粉和UDCA毒性小，能夠抑制肝癌增殖、生長，可能的機(jī)制包括下調(diào)VEGF、激活p53、提升機(jī)體免疫功能。推測除了UDCA，熊膽的其他成份也確切地發(fā)揮了抑瘤作用。
　　 第四部分熊膽粉對大鼠誘發(fā)性原位肝癌模型的影

10、響
　　 目的:探討熊膽粉干預(yù)腫瘤微環(huán)境，對原位肝癌模型的影響，為熊膽的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及熊膽高低兩個劑量組。二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）溶液代替飲水誘發(fā)肝癌，熊膽兩組用熊膽粉干預(yù)。觀察體重等一般情況，第18周末處死動物，記錄肝臟大體標(biāo)本情況及肝臟體重比值，HE染色觀察肝組織病理改變，檢測肝功能，免疫組化檢測肝組織中PCNA和平滑肌動蛋白(α

11、-SMA)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:與模型組比較，熊膽兩組體重升高(p＜0.05)，肝癌結(jié)節(jié)數(shù)目和直徑較小，肝臟體重比值亦明顯較小，肝硬化較輕、癌組織分化較好，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素顯著降低，PCNA和α-SMA表達(dá)水平降低，α-SMA減少有顯著意義，p＜0.05。
　　 結(jié)論:熊膽一定程度上延緩、抑制了DEN誘發(fā)肝癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，可能與減輕肝臟損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)，還可能與抑制肝星狀細(xì)胞活化進(jìn)而減輕肝纖維化、肝硬化有關(guān)

12、。
　　 第五部分熊膽粉聯(lián)合TACE治療中晚期肝癌的臨床研究
　　 目的:探討熊膽粉聯(lián)合TACE治療中晚期原發(fā)性肝癌的臨床療效及毒副作用。
　　 方法:將42例肝癌患者隨機(jī)分為聯(lián)合治療組21例和對照組21例。對照組予TACE及對癥治療，聯(lián)合治療組在此基礎(chǔ)上聯(lián)合口服中藥熊膽粉。3個月后觀察AFP、腫瘤客觀指標(biāo)、肝功能及分級、免疫功能、生存質(zhì)量、毒副反應(yīng)，隨訪12月比較生存率。
　　 結(jié)果:治療后兩組AFP均

13、明顯下降，而聯(lián)合組更加顯著(p＜0.05);聯(lián)合組和對照組的有效率分別為66.67％、61.90％，6月、9月、12月生存率分別為85.71％、80.95％、61.90％和76.19％、61.90％、52.38％，聯(lián)合組均有升高，其中9月生存率顯著升高(p＜0.05)。與對照組比較，聯(lián)合組的肝功能指標(biāo)和Child-pugh分級得到改善，CD3+、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+顯著升高，p＜0.05。而KPS評分和骨髓抑制方面，聯(lián)合組