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文檔簡介
1、目的:
濕疹-皮炎是一種瘙癢性、復發(fā)性的皮膚病,對患者生活有嚴重影響。目前濕疹-皮炎的治療還是個難題,傳統(tǒng)的皮質類固醇激素和免疫抑制劑均有不可忽視的副作用,且不能長期應用,開發(fā)研究中藥成為濕疹-皮炎治療的發(fā)展趨勢。
中醫(yī)中藥是中華民族歷史文化和現(xiàn)代文明的重要組成部分,中藥治療濕疹-皮炎在中醫(yī)醫(yī)籍上早有記載,為后人進一步研究和開發(fā)中藥提供了豐富的空間和資源。中藥復方茯苓湯(Fu Fang Fu Ling Tan
2、g,FFFLT)由茯苓、赤芍、梔子、澤瀉、黃柏、當歸、浮萍、甘草組成,前期的實驗研究及臨床應用證明,復方茯苓湯對小鼠變應性接觸性皮炎(allergiccontact dermatitis,ACD)有顯著抑制作用,臨床也可有效治療濕疹-皮炎。但復方茯苓湯的化學成分及其有效抗炎成分尚未研究,使其臨床應用、質量控制、產(chǎn)業(yè)化都受到限制。
近十年來,基于液相色譜的技術被廣泛應用于中藥的質量控制,尤其是LC的聯(lián)用技術液相色譜-質譜(l
3、iquid chromatography-mass spectra,LC-MS)和液相色譜-二極管陣列檢測器(liquidchromatography-photodiode array detector,LC-DAD),分別作為首選技術用于復雜中藥樣品中目標化合物的定性和定量分析。目前,超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)和超高速液相色譜(ultra fast liq
4、uid chromatography,UFLC)由于其色譜柱選用微粒填料,能獲得更高的柱效,節(jié)省分析時間,提高分析通量,適于快速分析植物樣品及天然產(chǎn)物,同時也推動了中藥藥理活性作用的研究。
肝臟是藥物主要的和重要的代謝器官,是藥物生物轉化的主要場所,大多數(shù)藥物的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應都是在肝藥酶系統(tǒng)的參與下發(fā)生的,因此藥物的體外代謝模型主要是以肝臟為基礎的,并以其特有的優(yōu)勢和特點在藥物代謝的研究中得到廣泛的應用。目前,有關藥物
5、代謝研究的熱點主要是以肝微粒體和肝細胞為基礎,通過分離培養(yǎng)的肝細胞及重組單酶進行藥物的體外代謝研究,了解藥物的代謝途徑、代謝穩(wěn)定性及經(jīng)代謝酶生物轉化的代謝產(chǎn)物,也可考察藥物經(jīng)代謝后對細胞的毒副作用。
濕疹-皮炎的免疫發(fā)病機制與T淋巴細胞密切相關。Th1和Th2型細胞亞群的平衡保持著機體正常免疫功能,而Th1/Th2免疫模式的確定是以Th1和Th2型細胞因子水平為主要依據(jù)。表皮海綿腫是濕疹-皮炎特征性病理變化,其機制是T細胞
6、誘導的角質形成細胞凋亡。濕疹-皮炎的活化CD4+T細胞分泌IFN-γ,是引發(fā)皮膚病理的主要細胞因子之一。
本研究以中藥復方茯苓湯為研究對象,先對復方茯苓湯在植物活性成分分離平臺上用超高速液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧-質譜(UFLC-DAD-ESI-MS)等方法進行主要化學成分分離,分析和鑒定;再結合中藥分析鑒定結果,選用2,4-二硝基氟苯(DNFB)誘導的小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)模型為藥效學實驗模型,進一步確定
7、復方茯苓湯在活體內的抗炎有效成分;再選取有效成分單體及其體內脫糖代謝產(chǎn)物進行體外藥物代謝研究,了解其代謝途徑、鑒定其代謝產(chǎn)物;最后,從有效成分單體中選定目標化合物,研究其對人外周血T淋巴細胞增殖的抑制、誘導凋亡,細胞周期的變化及對Th1、Th2型細胞因子的影響,從分子水平和免疫調節(jié)機制方面探討FFFLT中的目標化合物對濕疹.皮炎發(fā)病機制的影響。通過上述實驗,為復方茯苓湯的臨床應用提供理論依據(jù)。
方法和結果:
8、全文共分四部分。第一部分是采用UFLC-DAD-ESI-MS法分析復方茯苓湯的主要化學成分與質量控制。色譜條件:分析柱為Shim-packXR-ODS(75 mm×2.0 mm,2.2μm)和Shim-pack XR-ODS(100 mm×2.0 mm,2.2μm),以乙腈(A)及0.1%甲酸-水(B)為流動相,采用梯度程序洗脫,流速為0.4 mL/min,柱溫設定在40℃。質譜條件:在正負離子模式下分別掃描,檢測器電壓分別為+1.55
9、kV與-1.55kV;掃描范圍為m/z100~500:曲線脫溶劑管和加熱塊溫度均為250℃,接口電壓為4 kV,CDL電壓為40 V:霧化氣(氮氣)流速設定在1.5 L/min,干燥氣壓力設定為0.06 Mpa。結果:復方茯苓湯中共分析出14種成分,其中主要化學成分為京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷,其最大吸收波長分別為239 nm,239 nm,230 nm及276 nm。在本研究方法下,京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及
10、甘草苷的保留時間分別為4.30min,4.84min,5.46min及6.11min,四種成分的定量線性范圍在1.0 ng~200 ng之間,線性相關系數(shù)R2介于0.9998~1.0之間,日內差及日間差測定顯示4個目標物的保留時間及峰面積相對標準偏差均小于1.7%;平均加樣回收率介于95%~104%之間。
第二部分是研究復方茯苓湯作用于小鼠皮炎的有效組分。用2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzen
11、e,DNFB)誘發(fā)的小鼠變應性接觸性皮炎為動物模型,比較灌飼不同中藥組合(Ⅰ-Ⅳ)及陽性對照氫化可的松和陰性對照生理鹽水的藥效學指標:Ⅰ組為茯苓,澤瀉,黃柏,梔子,赤芍,浮萍,當歸,甘草8味中藥(復方茯苓湯)的水提物,Ⅱ組為梔子,赤芍,甘草3味中藥的水提物,Ⅲ組為茯苓,當歸2味中藥的水提物,Ⅳ組為茯苓,梔子,赤芍,當歸,甘草5味中藥的水提物。觀察中藥對小鼠耳重量、耳厚度、耳真皮炎性細胞浸潤以及血清細胞因子的影響。結果:與生理鹽水組比較,
12、不同中藥組和氫化可的松組對誘發(fā)皮炎前后小鼠的耳重量差、耳厚度差及真皮炎癥細胞浸潤的影響均有顯著差異(P<0.05),其中,8味中藥組、5味中藥組和氫化可的松組更優(yōu)(P<0.01)。與生理鹽水組比較,氫化可的松組和中藥組小鼠血清IFN-γ水平均有顯著降低(P<0.05),8味組和氫化可的松組尤為明顯(P<0.01);而各組IL-4,IL-10水平無顯著性差異(P>0.05)。
第三部分是對該復方中的有效成分單體及其體內脫糖代
13、謝產(chǎn)物進行體外代謝研究。采用體外肝微粒體孵育體系及肝細胞培養(yǎng)體系結合超快速液相色譜-質譜(UFLC-MS)技術,通過特異性細胞色素酶(CYP)抑制劑,重組單酶及相關性分析,對以上成分進行代謝酶研究及主要代謝產(chǎn)物分析。結果:芍藥苷、京尼平苷、京尼平、甘草苷都不經(jīng)肝臟Ⅰ相酶代謝;甘草苷的脫糖產(chǎn)物甘草素與人肝微粒體(HLMs)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-孵育體系孵育30 min后,產(chǎn)生一個代謝產(chǎn)物,為4',5,7-三羥基黃酮。采用9
14、種主要CYP的選擇性抑制劑來測定HLMs中產(chǎn)生4',5,7-三羥基黃酮的CYP亞型,確定CYP1A2為生成該代謝產(chǎn)物的主要代謝酶。
第四部分是研究芍藥苷抑制人外周血T淋巴細胞增殖、誘導凋亡及其對Th1及Th2型細胞因子的影響。采用SRB法檢測CD3+CD28共刺激下的T淋巴細胞增殖及芍藥苷對其增殖的抑制,流式細胞術檢測芍藥苷誘導T淋巴細胞凋亡及其細胞周期的變化,ELISA法分析芍藥苷對T淋巴細胞上清中細胞因子的影響。結果:
15、不同濃度芍藥苷加藥組與CD3+CD28組相比較,可呈濃度依賴性抑制CD3+CD28共刺激下的T淋巴細胞增殖(P<0.01);不同濃度芍藥苷加藥組誘導活化的T淋巴細胞凋亡與CD3+CD28組比較,有顯著性差異(P<0.01)。與CD3+CD28組相比較,不同濃度芍藥苷加藥組均能顯著降低T淋巴細胞上清液中IFN-γ的水平(P<0.01),而對T淋巴細胞上清液中IL-4水平的影響無顯著性差異(P>0.01)。
結論:
16、 1.本研究采用UFLC-DAD-ESI-MS法首次對復方茯苓湯的化學成分進行分析,共分析出14種成分,其中主要化學成分是京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷。
2.基于UFLC-DAD技術開發(fā)了復方茯苓湯中京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷4種主要化學成分的快速定量分析方法。該方法快速、靈敏,穩(wěn)定可靠,適于分析復方茯苓湯提取物中的活性成分,可用于復方茯苓湯原材料的質量控制。
3.復方茯苓湯的
17、主要藥效成分多來源于梔子,赤芍,甘草,茯苓和當歸5味中藥。復方茯苓湯抑制DNFB誘發(fā)的小鼠ACD的作用機制可能與降低IFN-γ水平有關。
4.復方茯苓湯中甘草苷的脫糖產(chǎn)物甘草素可被肝臟I相酶代謝,代謝產(chǎn)物是4',5,7-三羥基黃酮,CYP1 A2為生成該代謝產(chǎn)物的主要代謝酶。澄清甘草素的代謝產(chǎn)物和代謝酶有利于對代謝產(chǎn)物的藥理和毒理學活性進行深入研究,也可指導含甘草素藥物的臨床用藥。
5.復方茯苓湯中芍藥苷可抑
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