復(fù)方茯苓湯有效成分及其主要成分單體的藥理活性研究.pdf

1、目的:
　　 濕疹-皮炎是一種瘙癢性、復(fù)發(fā)性的皮膚病,對(duì)患者生活有嚴(yán)重影響。目前濕疹-皮炎的治療還是個(gè)難題,傳統(tǒng)的皮質(zhì)類(lèi)固醇激素和免疫抑制劑均有不可忽視的副作用,且不能長(zhǎng)期應(yīng)用,開(kāi)發(fā)研究中藥成為濕疹-皮炎治療的發(fā)展趨勢(shì)。
　　 中醫(yī)中藥是中華民族歷史文化和現(xiàn)代文明的重要組成部分,中藥治療濕疹-皮炎在中醫(yī)醫(yī)籍上早有記載,為后人進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)中藥提供了豐富的空間和資源。中藥復(fù)方茯苓湯(Fu Fang Fu Ling Tan

2、g,FFFLT)由茯苓、赤芍、梔子、澤瀉、黃柏、當(dāng)歸、浮萍、甘草組成,前期的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用證明,復(fù)方茯苓湯對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(allergiccontact dermatitis,ACD)有顯著抑制作用,臨床也可有效治療濕疹-皮炎。但復(fù)方茯苓湯的化學(xué)成分及其有效抗炎成分尚未研究,使其臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制、產(chǎn)業(yè)化都受到限制。
　　 近十年來(lái),基于液相色譜的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制,尤其是LC的聯(lián)用技術(shù)液相色譜-質(zhì)譜(l

3、iquid chromatography-mass spectra,LC-MS)和液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(liquidchromatography-photodiode array detector,LC-DAD),分別作為首選技術(shù)用于復(fù)雜中藥樣品中目標(biāo)化合物的定性和定量分析。目前,超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)和超高速液相色譜(ultra fast liq

4、uid chromatography,UFLC)由于其色譜柱選用微粒填料,能獲得更高的柱效,節(jié)省分析時(shí)間,提高分析通量,適于快速分析植物樣品及天然產(chǎn)物,同時(shí)也推動(dòng)了中藥藥理活性作用的研究。
　　 肝臟是藥物主要的和重要的代謝器官,是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所,大多數(shù)藥物的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應(yīng)都是在肝藥酶系統(tǒng)的參與下發(fā)生的,因此藥物的體外代謝模型主要是以肝臟為基礎(chǔ)的,并以其特有的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)在藥物代謝的研究中得到廣泛的應(yīng)用。目前,有關(guān)藥物

5、代謝研究的熱點(diǎn)主要是以肝微粒體和肝細(xì)胞為基礎(chǔ),通過(guò)分離培養(yǎng)的肝細(xì)胞及重組單酶進(jìn)行藥物的體外代謝研究,了解藥物的代謝途徑、代謝穩(wěn)定性及經(jīng)代謝酶生物轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物,也可考察藥物經(jīng)代謝后對(duì)細(xì)胞的毒副作用。
　　 濕疹-皮炎的免疫發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。Th1和Th2型細(xì)胞亞群的平衡保持著機(jī)體正常免疫功能,而Th1/Th2免疫模式的確定是以Th1和Th2型細(xì)胞因子水平為主要依據(jù)。表皮海綿腫是濕疹-皮炎特征性病理變化,其機(jī)制是T細(xì)胞

6、誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。濕疹-皮炎的活化CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ,是引發(fā)皮膚病理的主要細(xì)胞因子之一。
　　 本研究以中藥復(fù)方茯苓湯為研究對(duì)象,先對(duì)復(fù)方茯苓湯在植物活性成分分離平臺(tái)上用超高速液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-電噴霧-質(zhì)譜(UFLC-DAD-ESI-MS)等方法進(jìn)行主要化學(xué)成分分離,分析和鑒定;再結(jié)合中藥分析鑒定結(jié)果,選用2,4-二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)的小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?進(jìn)一步確定

7、復(fù)方茯苓湯在活體內(nèi)的抗炎有效成分;再選取有效成分單體及其體內(nèi)脫糖代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外藥物代謝研究,了解其代謝途徑、鑒定其代謝產(chǎn)物;最后,從有效成分單體中選定目標(biāo)化合物,研究其對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的抑制、誘導(dǎo)凋亡,細(xì)胞周期的變化及對(duì)Th1、Th2型細(xì)胞因子的影響,從分子水平和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面探討FFFLT中的目標(biāo)化合物對(duì)濕疹.皮炎發(fā)病機(jī)制的影響。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),為復(fù)方茯苓湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法和結(jié)果:
　　

8、全文共分四部分。第一部分是采用UFLC-DAD-ESI-MS法分析復(fù)方茯苓湯的主要化學(xué)成分與質(zhì)量控制。色譜條件:分析柱為Shim-packXR-ODS(75 mm×2.0 mm,2.2μm)和Shim-pack XR-ODS(100 mm×2.0 mm,2.2μm),以乙腈(A)及0.1％甲酸-水(B)為流動(dòng)相,采用梯度程序洗脫,流速為0.4 mL/min,柱溫設(shè)定在40℃。質(zhì)譜條件:在正負(fù)離子模式下分別掃描,檢測(cè)器電壓分別為+1.55

9、kV與-1.55kV;掃描范圍為m/z100～500:曲線脫溶劑管和加熱塊溫度均為250℃,接口電壓為4 kV,CDL電壓為40 V:霧化氣(氮?dú)?流速設(shè)定在1.5 L/min,干燥氣壓力設(shè)定為0.06 Mpa。結(jié)果:復(fù)方茯苓湯中共分析出14種成分,其中主要化學(xué)成分為京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷,其最大吸收波長(zhǎng)分別為239 nm,239 nm,230 nm及276 nm。在本研究方法下,京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及

10、甘草苷的保留時(shí)間分別為4.30min,4.84min,5.46min及6.11min,四種成分的定量線性范圍在1.0 ng～200 ng之間,線性相關(guān)系數(shù)R2介于0.9998～1.0之間,日內(nèi)差及日間差測(cè)定顯示4個(gè)目標(biāo)物的保留時(shí)間及峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.7%;平均加樣回收率介于95%～104%之間。
　　 第二部分是研究復(fù)方茯苓湯作用于小鼠皮炎的有效組分。用2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzen

11、e,DNFB)誘發(fā)的小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎為動(dòng)物模型,比較灌飼不同中藥組合(Ⅰ-Ⅳ)及陽(yáng)性對(duì)照氫化可的松和陰性對(duì)照生理鹽水的藥效學(xué)指標(biāo):Ⅰ組為茯苓,澤瀉,黃柏,梔子,赤芍,浮萍,當(dāng)歸,甘草8味中藥(復(fù)方茯苓湯)的水提物,Ⅱ組為梔子,赤芍,甘草3味中藥的水提物,Ⅲ組為茯苓,當(dāng)歸2味中藥的水提物,Ⅳ組為茯苓,梔子,赤芍,當(dāng)歸,甘草5味中藥的水提物。觀察中藥對(duì)小鼠耳重量、耳厚度、耳真皮炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及血清細(xì)胞因子的影響。結(jié)果:與生理鹽水組比較,

12、不同中藥組和氫化可的松組對(duì)誘發(fā)皮炎前后小鼠的耳重量差、耳厚度差及真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響均有顯著差異(P＜0.05),其中,8味中藥組、5味中藥組和氫化可的松組更優(yōu)(P＜0.01)。與生理鹽水組比較,氫化可的松組和中藥組小鼠血清IFN-γ水平均有顯著降低(P＜0.05),8味組和氫化可的松組尤為明顯(P＜0.01);而各組IL-4,IL-10水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 第三部分是對(duì)該復(fù)方中的有效成分單體及其體內(nèi)脫糖代

13、謝產(chǎn)物進(jìn)行體外代謝研究。采用體外肝微粒體孵育體系及肝細(xì)胞培養(yǎng)體系結(jié)合超快速液相色譜-質(zhì)譜(UFLC-MS)技術(shù),通過(guò)特異性細(xì)胞色素酶(CYP)抑制劑,重組單酶及相關(guān)性分析,對(duì)以上成分進(jìn)行代謝酶研究及主要代謝產(chǎn)物分析。結(jié)果:芍藥苷、京尼平苷、京尼平、甘草苷都不經(jīng)肝臟Ⅰ相酶代謝;甘草苷的脫糖產(chǎn)物甘草素與人肝微粒體(HLMs)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-孵育體系孵育30 min后,產(chǎn)生一個(gè)代謝產(chǎn)物,為4',5,7-三羥基黃酮。采用9

14、種主要CYP的選擇性抑制劑來(lái)測(cè)定HLMs中產(chǎn)生4',5,7-三羥基黃酮的CYP亞型,確定CYP1A2為生成該代謝產(chǎn)物的主要代謝酶。
　　 第四部分是研究芍藥苷抑制人外周血T淋巴細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及其對(duì)Th1及Th2型細(xì)胞因子的影響。采用SRB法檢測(cè)CD3+CD28共刺激下的T淋巴細(xì)胞增殖及芍藥苷對(duì)其增殖的抑制,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芍藥苷誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞周期的變化,ELISA法分析芍藥苷對(duì)T淋巴細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的影響。結(jié)果:

15、不同濃度芍藥苷加藥組與CD3+CD28組相比較,可呈濃度依賴性抑制CD3+CD28共刺激下的T淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.01);不同濃度芍藥苷加藥組誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡與CD3+CD28組比較,有顯著性差異(P＜0.01)。與CD3+CD28組相比較,不同濃度芍藥苷加藥組均能顯著降低T淋巴細(xì)胞上清液中IFN-γ的水平(P＜0.01),而對(duì)T淋巴細(xì)胞上清液中IL-4水平的影響無(wú)顯著性差異(P＞0.01)。
　　 結(jié)論:
　　

16、 1.本研究采用UFLC-DAD-ESI-MS法首次對(duì)復(fù)方茯苓湯的化學(xué)成分進(jìn)行分析,共分析出14種成分,其中主要化學(xué)成分是京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷。
　　 2.基于UFLC-DAD技術(shù)開(kāi)發(fā)了復(fù)方茯苓湯中京尼平龍膽雙糖苷,京尼平苷,芍藥苷及甘草苷4種主要化學(xué)成分的快速定量分析方法。該方法快速、靈敏,穩(wěn)定可靠,適于分析復(fù)方茯苓湯提取物中的活性成分,可用于復(fù)方茯苓湯原材料的質(zhì)量控制。
　　 3.復(fù)方茯苓湯的

17、主要藥效成分多來(lái)源于梔子,赤芍,甘草,茯苓和當(dāng)歸5味中藥。復(fù)方茯苓湯抑制DNFB誘發(fā)的小鼠ACD的作用機(jī)制可能與降低IFN-γ水平有關(guān)。
　　 4.復(fù)方茯苓湯中甘草苷的脫糖產(chǎn)物甘草素可被肝臟I相酶代謝,代謝產(chǎn)物是4',5,7-三羥基黃酮,CYP1 A2為生成該代謝產(chǎn)物的主要代謝酶。澄清甘草素的代謝產(chǎn)物和代謝酶有利于對(duì)代謝產(chǎn)物的藥理和毒理學(xué)活性進(jìn)行深入研究,也可指導(dǎo)含甘草素藥物的臨床用藥。
　　 5.復(fù)方茯苓湯中芍藥苷可抑