木薯CC-type MeGRXs及MeDREB1D基因抗旱功能研究.pdf

1、木薯(Manihot esculenta Crantz)，是一種重要的熱帶塊根作物，由于具有抗旱、耐貧瘠的特點(diǎn)，是熱帶及亞熱帶干旱貧瘠地區(qū)主要的糧食來(lái)源。但目前有關(guān)木薯抗旱機(jī)制的研究相對(duì)較少，尤其是相關(guān)基因的功能研究還鮮見報(bào)道。前期研究表明木薯在受到干旱脅迫時(shí)，其谷氧還蛋白基因(GRX)以及DREB1D基因被顯著誘導(dǎo)，但GRX和DREB1D在木薯抗旱中的作用還不清楚。本文中系統(tǒng)研究了木薯基因組內(nèi)的eGRXs基因家族，同時(shí)通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化體系

2、對(duì)MeGRXs以及MeDREB1D基因進(jìn)行抗旱功能分析。主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)與擬南芥GRX序列比對(duì)，從木薯基因組中篩選出38個(gè)MeGRXs。遺傳進(jìn)化樹分析顯示，38個(gè)MeGRXs可劃分為四類，分別為CC-type、CPYC、CGFS和GRL，植物特有CC-type GRX含有17個(gè)MeGRXs基因，占比最高。表達(dá)譜分析顯示，17個(gè) CC-type MeGRXs中14個(gè)受干旱誘導(dǎo)表達(dá)，其中6個(gè)(MeGRX232、MeGRX3

3、60、MeGRX785、MeGRX058、MeGRX892和MeGRX496)在木薯抗旱品種SC124葉片中顯著上調(diào)表達(dá)。
　　2.將MeGRX785和MeGRX058過(guò)表達(dá)及RNA干涉轉(zhuǎn)基因木薯本體進(jìn)行抗旱功能分析，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MeGRX785木薯植株對(duì)干旱敏感，而RNA干涉MeGRX785木薯植株提高了植株的抗旱性。與MeGRX785不同，過(guò)表達(dá)MeGRX058轉(zhuǎn)基因木薯提高了植株抗旱性，而RNA干涉植株表現(xiàn)為對(duì)干旱敏感。同

4、時(shí)將MeGRX785和MeGRX058轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行抗旱性分析，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)基因木薯抗旱評(píng)價(jià)結(jié)果一致，過(guò)表達(dá)MeGRX785擬南芥植株對(duì)干旱敏感，而過(guò)表達(dá)MeGRX058擬南芥抗旱，表明以擬南芥為模式植物對(duì)木薯MeGRXs基因進(jìn)行功能分析具有可行性?；谏鲜鼋Y(jié)果，采用擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行MeGRX232和MeGRX360抗旱功能分析，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MeGRX232擬南芥植株對(duì)ABA敏感較弱，對(duì)干旱敏感，而過(guò)表達(dá)MeGRX360擬南芥對(duì)干旱

5、表現(xiàn)出一定的抗性，與MeGRX785和MeGRX058抗旱功能差異具有對(duì)應(yīng)性，表明不同MeGRX基因?qū)δ臼淼目购嫡{(diào)節(jié)具有不同的作用機(jī)制。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)譜分析顯示，與乙稀調(diào)控相關(guān)的ERF、GA2OX6等基因在過(guò)表達(dá)MeGRX232和MeGRX785轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，可能對(duì)兩者在干旱負(fù)調(diào)控作用中起著一定作用，也表明MeGRX可能通過(guò)乙稀信號(hào)途徑對(duì)木薯植株進(jìn)行干旱調(diào)控。
　　3.對(duì)MeGRX785和MeGR

6、X058基因抗旱功能差異進(jìn)行分析，蛋白序列比對(duì)顯示，MeGRX785和MeGRX058 C末端ALWL元件的差異，可能是兩者抗旱功能差異的主要原因。將兩者轉(zhuǎn)化酵母菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活顯色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MeGRX785酵母轉(zhuǎn)化菌株具有自激活顯色現(xiàn)象，而MeGRX058沒(méi)有，與木薯抗旱功能的差異具有對(duì)應(yīng)性。對(duì)MeGRX785和MeGRX058 ALWL元件進(jìn)行氨基酸刪除和突變分析，結(jié)果顯示刪除MeGRX785 ALWL元件及將ALWL第一個(gè)丙氨酸

7、(A)突變?yōu)楦拾彼?G)將使MeGRX785失去轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象，但將MeGRX058 ALWL元件的第一個(gè)G突變A，MeGRX058產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象，因此得出ALWL元件對(duì)MeGRX785的功能作用具有重要作用，且ALWL元件中A位點(diǎn)的差異是引起MeGRX785和MeGRX058功能差異的主要原因。將MeGRX058 ALWL元件突變序列(058mC)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明突變序列產(chǎn)生了對(duì)干旱的敏感性，驗(yàn)證了ALWL元件

8、中A位點(diǎn)的差異是引起MeGRX785和MeGRX058抗旱功能差異的主要原因。利用氨基酸突變結(jié)合酵母遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)MeGRX785中的CDMC、L**LL和P****G蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行功能分析顯示，刪除L**LL元件的后兩個(gè)L或?qū)⒑髢蓚€(gè)L替換成天冬氨酸(NN)，將P****G元件突變?yōu)長(zhǎng)****G和P****D以及將CDMC突變?yōu)锳DMA也均使MeGRX785失去轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象。將MeGRX785 L**LL和P****G元件突變序列(785

9、mLL和785mG)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示突變序列失去對(duì)干旱的敏感性，表明MeGRX785功能是各結(jié)構(gòu)域綜合作用的結(jié)果。比較MeGRX232和MeGRX360蛋白序列顯示，兩者功能結(jié)構(gòu)域無(wú)明顯差異，但兩者的亞細(xì)胞定位不同，其中MeGRX232定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，MeGRX360主要定位在細(xì)胞核中，而是否為其功能差異的原因還有待進(jìn)一步研究。
　　4.表達(dá)譜分析顯示MeDREB1D受干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，基因克隆測(cè)序獲得

10、兩個(gè)等位基因MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)，序列分析顯示兩者在NLS結(jié)構(gòu)域上有1個(gè)氨基酸的差異。亞細(xì)胞定位顯示MeDREB1D(R-2)主要定位在細(xì)胞核中，但MeDREB1D(Y-3)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中?？剐苑治鲲@示，過(guò)表達(dá)MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)轉(zhuǎn)基因擬南芥均可提高植株的抗旱性和抗寒性。但過(guò)表達(dá)MeDREB1D(R-2)擬南芥在正常條件下表現(xiàn)為矮化表型和開花延遲現(xiàn)象，而MeDR

11、EB1D(Y-3)與野生型無(wú)明顯差異。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RNA-Seq分析顯示，多個(gè)POD基因在轉(zhuǎn)基因植株中顯著上調(diào)表達(dá)，可能是轉(zhuǎn)基因植株抗旱及抗寒性提高的原因。通路分析顯示MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)在“Photosynthesis”和“Photosynthesis-antenna proteins”通路富集差異較大，MeDREB1D(R-2)轉(zhuǎn)基因植株在兩條通路中有28個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，但MeDREB1D(Y-