棉花(Gossypium hirsutum)干旱應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組分析及DRPP1基因在棉花抗旱中的功能研究.pdf

1、干旱是影響植物生存、生長和分布的最重要的非生物脅迫之一。據(jù)估計(jì)，全球由于缺水而導(dǎo)致的農(nóng)作物減產(chǎn)占所有環(huán)境因素導(dǎo)致的作物減產(chǎn)的50％以上。棉花是世界上最主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，由于我國新疆及長江流域(特別是湖北、湖南、江西等省)夏秋時(shí)節(jié)經(jīng)常晴熱少雨，伏旱的發(fā)生比較頻繁，造成棉花水分供需失調(diào)，葉片萎蔫，植株生長發(fā)育受阻，棉鈴脫落嚴(yán)重，對(duì)棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)影響非常大。因此，研究提高棉花的抗旱性，對(duì)于我國棉花產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展極其重要。
　　蛋白的

2、可逆磷酸化在各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的作用，調(diào)控著真核生物中大多數(shù)的生物學(xué)過程。蛋白激酶(PK)和磷酸酶(PPs)對(duì)于細(xì)胞在正常和逆境條件下磷酸化狀態(tài)的維持是非常關(guān)鍵的。已有研究發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶對(duì)生物體內(nèi)的有關(guān)代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中，PP2C蛋白磷酸酶在調(diào)控細(xì)胞周期、脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等細(xì)胞活動(dòng)過程中發(fā)揮重要的作用。在植物中，除了報(bào)道較多的A類PP2Cs外，其他類別的PP2C也在植物發(fā)育和抗逆性方面發(fā)揮

3、重要作用。作為植物體內(nèi)較大的一類蛋白磷酸酶家族，PP2C具有特殊的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，并參與植物體內(nèi)多種信號(hào)途徑，而植物體內(nèi)PP2C家族蛋白的多樣性則表明其在不同的組織和器官中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的多樣性。但是，要清楚地了解PP2C蛋白的分子功能和作用機(jī)制是一項(xiàng)艱巨的工作。而且，在PP2C蛋白磷酸酶在植物抗逆過程中的直接作用底物的研究方面，目前仍然不是很清楚，特別是棉花中關(guān)于PP2C功能的報(bào)道極少。因此，對(duì)于PP2C蛋白在棉花抗逆中的功能研究具

4、有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等方法，本文對(duì)兩個(gè)具有不同抗旱性的棉花品種在干旱脅迫下的葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)有許多基因在干旱脅迫下差異表達(dá)。在上調(diào)表達(dá)的基因中，鑒定了一個(gè)編碼PP2C蛋白的基因，命名為GhDRPP1(Drought Related PP2C1)。利用過量表達(dá)和基因沉默的技術(shù)方法，本文對(duì)GhDRPP1在棉花干旱應(yīng)答過程中的功能及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，獲得以下主要結(jié)果:
　　1.抗旱品種

5、晉棉13號(hào)和干旱敏感品種魯棉6號(hào)在干旱脅迫下的比較轉(zhuǎn)錄組分析
　　采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)抗旱品種晉棉13號(hào)和干旱敏感品種魯棉6號(hào)在干旱處理時(shí)期的葉片進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在干旱脅迫下大約有13.38％～18.75％Unigene的表達(dá)發(fā)生了變化，與對(duì)照相比，晉棉13號(hào)植株中差異表達(dá)基因的數(shù)量隨著干旱處理時(shí)間增加而增加;GO功能聚類分析顯示，很大一部分差異表達(dá)基因涉及到代謝、運(yùn)輸、防御應(yīng)答、蛋白質(zhì)修飾、激

6、素信號(hào)應(yīng)答等生物學(xué)過程，這表明干旱脅迫影響棉花的生長發(fā)育和代謝過程;對(duì)晉棉13號(hào)在整個(gè)干旱時(shí)期的差異表達(dá)基因進(jìn)行共差異表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，晉棉13號(hào)有627個(gè)基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，229個(gè)基因持續(xù)下調(diào)表達(dá)，這說明持續(xù)的干旱脅迫引起細(xì)胞內(nèi)一些特定的基因表達(dá)變化來調(diào)控棉花抗旱應(yīng)答過程;細(xì)胞壁合成、非生物脅迫應(yīng)答、ABA信號(hào)應(yīng)答、碳水化合物的合成與代謝等相關(guān)基因在于旱處理的整個(gè)過程中都富集性高表達(dá)，而乙烯信號(hào)通路相關(guān)基因富集性低表達(dá)，暗

7、示了晉棉13號(hào)可能通過激活A(yù)BA信號(hào)通路和其他代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)來抵御干旱脅迫。
　　干旱處理6d的晉棉13號(hào)和魯棉6號(hào)之間的差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，大約一萬多個(gè)基因發(fā)生了差異表達(dá);與魯棉6號(hào)相比，非生物脅迫應(yīng)答、細(xì)菌防御應(yīng)答、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、ABA信號(hào)應(yīng)答等相關(guān)基因在晉棉13號(hào)中富集性高表達(dá)，乙烯、茉莉酸合成與代謝通路等相關(guān)基因低表達(dá)，暗示了這些信號(hào)通路可能參與棉花對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及耐受性。
　　2.GhDRPP1基

8、因的克隆鑒定及表達(dá)分析
　　通過上述轉(zhuǎn)錄組分析，從棉花中分離鑒定了一個(gè)PP2C家族基因，命名為GhDRPP1(CotAD_18479)。表達(dá)分析結(jié)果顯示，GhDRPP1在棉花各組織中均有表達(dá)，并且該基因在棉花葉片和根中的表達(dá)受ABA、甘露醇、NaCl的強(qiáng)烈誘導(dǎo);在干旱處理時(shí)期，GhDRPP1在晉棉13和魯棉6號(hào)的棉花葉片中都顯著上調(diào)表達(dá)。干旱處理3d和5d時(shí)，晉棉13中GhDRPP1基因的表達(dá)量要高于魯棉6號(hào)，這表明GhDRPP1

9、是一個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)的基因，可能參與棉花干旱脅迫的應(yīng)答過程。
　　3.GhDRPP1編碼一個(gè)PP2C蛋白磷酸酶
　　GhDRPP1蛋白比對(duì)和進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，該蛋白可能是一個(gè)PP2C蛋白磷酸酶。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白定位在細(xì)胞核中;構(gòu)建了MBP-GhDRPP1的融合表達(dá)載體，在體外對(duì)GhDRPP1蛋白磷酸酶的活性進(jìn)行了測定分析，結(jié)果顯示該蛋白具有PP2C蛋白磷酸酶的活性。
　　4.過量表達(dá)GhDRPP1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因

10、擬南芥對(duì)干旱敏感
　　構(gòu)建了GhDRPP1過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥在ABA和甘露醇處理?xiàng)l件下種子萌發(fā)率和綠苗率進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示ABA處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率和綠苗率要高于野生型，而甘露醇處理?xiàng)l件下種子萌發(fā)率和綠苗率要低于野生型，說明GhDRPP1過量表達(dá)導(dǎo)致擬南芥對(duì)ABA不敏感和對(duì)甘露醇敏感;轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理后的表型觀察結(jié)果顯示，干旱處理20d后GhDRPP1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)

11、萎蔫現(xiàn)象，而野生型擬南芥植株生長狀態(tài)良好;干旱23d后對(duì)植株進(jìn)行復(fù)水，并對(duì)復(fù)水2d后植株的成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的成活率顯著低于野生型，上述結(jié)果說明GhDRPP1的過量表達(dá)增加了擬南芥對(duì)干旱的敏感性，導(dǎo)致植株不耐旱。對(duì)ABA和甘露醇處理?xiàng)l件下的GhDRPP1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中ABA和脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在ABA和甘露醇處理后，轉(zhuǎn)基因植株中RD22、COR15、NHX1、CBF3基因的表達(dá)量均顯著低于

12、野生型。這些結(jié)果暗示了GhDRPP1過量表達(dá)植株對(duì)干旱敏感的表型可能是由于ABA和逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)所引起的。
　　5.GhDRPP1在棉花干旱應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用
　　構(gòu)建了GhDRPP1過量表達(dá)載體和基因沉默(RNA干擾)相關(guān)載體，分別轉(zhuǎn)化棉花，收獲T1和T2代種子后，分別對(duì)T1和T2代轉(zhuǎn)基因棉花表型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示GhDRPP1的過量表達(dá)棉花植株相對(duì)于野生型干旱敏感，而GhDRPP1RNAi棉花植株相

13、對(duì)于野生型更加耐旱。生理指標(biāo)的測定結(jié)果顯示，在干旱處理?xiàng)l件下GhDRPP1的過量表達(dá)棉花植株中的MDA和H2O2的含量都高于野生型，而GhDRPP1RNAi棉花植株中的MDA和H2O2的含量都低于野生型，說明GhDRPP1的過量表達(dá)植株受到干旱脅迫的影響更加嚴(yán)重;相反，植物體內(nèi)的清除ROS相關(guān)的保護(hù)性酶的酶含量(如SOD、POD等)在GhDRPP1RNAi植株中高于野生型，而在GhDRPP1過量表達(dá)植株中低于野生型，脯氨酸含量的測定也得

14、到類似結(jié)果，這說明GhDRPP1RNAi植株耐旱能力的提高可能是由于增強(qiáng)了這些ROS清除酶含量和脯氨酸含量的原因;另外，脅迫應(yīng)答相關(guān)基因(如GXH-PX8、GST8、RD22、KIN10等)的表達(dá)在GhDRPP1RNAi植株中高于野生型，而在GhDRPP1過量表達(dá)植株中低于野生型，這些結(jié)果說明，GhDRPP1RNAi植株可能通過增強(qiáng)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來抵御干旱脅迫。
　　6.GhDRPP1互作蛋白的篩選及相互作用分析
　　為