分子佐劑對生長抑素基因免疫的作用及其機制研究.pdf

1、以生長抑素基因(ss)與乙肝表面抗原(HBsAg，S)基因融合的真核表達質(zhì)粒pES／2SS為基礎(chǔ)，制備S/2SS與GM-CSF基因的融合表達質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒及細菌DNA等，免疫小鼠及湖羊，探討影響生長抑素基因疫苗免疫應(yīng)答及促生長效果的因素，了解生長抑素基因免疫動物的作用機制，建立合適的生長抑素基因免疫程序，為最終獲得經(jīng)濟有效的生長抑素基因免疫方法和疫苗、開發(fā)促生長、提高畜牧生產(chǎn)效率的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。 1.S/2SS與GMCSF

2、基因的融合表達質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒的構(gòu)建 ①pES/2SS-GMCSF表達產(chǎn)物抗原表位預(yù)測應(yīng)用DNA軟件分析質(zhì)粒pES/2SS-GMCSF及pES/2SS融合基因表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和理化特性，發(fā)現(xiàn)二者s/2ss區(qū)域抗原表位一致。同樣，在插入生長抑素氨基酸序列的2個區(qū)域存在抗原表位。在pES/2SS-GMCSF質(zhì)粒中，s/2ss區(qū)域以外有另外的抗原表位區(qū)，推測GMCSF不改變s/ss表達產(chǎn)物抗原表位，且能夠增強生長抑素免疫學(xué)活性

3、。 S/2SS與GMCSF基因的融合表達質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 酶切pCS/2SS-GMCSF質(zhì)粒獲得GMCSF小片段，插入到pES/2SS(有終止密碼子)和pEGS/2SS(無終止密碼子，能表達GFP蛋白)大片段中，構(gòu)建pEs/2ss-GMCSF和pEGS/2SS-GMCSF：以pEGFP-N1為質(zhì)粒載體，類似方法酶切pCGMCSF質(zhì)粒得到GMCSF小片段，合成CpG基因退火成雙鏈，構(gòu)建成pE—GMCSF和p

4、E-CpG基因佐劑質(zhì)粒；酶切、測序鑒定表明，基因的插入位點、方向、序列完全正確。采用脂質(zhì)體包裹法將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞使其表達，用間接ELISA或熒光顯微鏡對其表達產(chǎn)物進行檢測。結(jié)果表明，pEGS/2SS-GMCSF轉(zhuǎn)染72h后的COS細胞檢出強烈熒光。ELISA結(jié)果顯示，質(zhì)粒表達的融合蛋白均具有SS的免疫學(xué)活性，表明融合表達質(zhì)粒均可在哺乳動物細胞中表達具有生長抑素免疫學(xué)活性的融合蛋白，而表達水平pEGS/2SS

5、pEGS/2SS-GMCSF

6、行免疫。疫苗劑量為20μg/只，佐劑按等量與之混合。初次免疫2周后以相同劑量 加強免疫一次。 ELISA法檢測抗體水平和抗體類型， MTT法檢測淋巴細胞增殖能力，結(jié)果顯示，CpGDNA和DNA疫苗聯(lián)合免疫后SS抗體水平、IgG2a／IgG1比值和脾淋巴細胞刺激活性(Stimulate Index，SI)值均比單一使用DNA疫苗的高(P<0.05)。免疫后4周SS抗體P／N值達峰值，以pES／2SS+CpGODN組最高。對Th

7、<,1>／Th<,2>細胞免疫應(yīng)答分型檢測，確定CpGDNA激發(fā)的抗體以IgG2a型抗體為主，RT-PCR檢測進一步證實CpGDNA佐劑組免疫鼠只選擇性表達Th<,1>型細胞因子。這些結(jié)果表明，應(yīng)用重組生長抑素真核表達質(zhì)粒免疫動物可以產(chǎn)生SS抗體。而含CpGDNA序列的核酸佐劑產(chǎn)生了TH<,1>型免疫佐劑效應(yīng)，增強了生長抑素基因疫苗的免疫效果。 3、CpGDNA系列佐劑對生長抑素基因疫苗免疫小鼠生長及GH和IGF-I的影響

8、 本試驗同樣免疫60只小鼠，雙抗RIA法檢測GH及IGF-I水平。結(jié)果顯示，雌性小鼠免疫后4、6周，疫苗組平均增重顯著高于對照組(P<0.05)。CpGDNA和DNA疫苗聯(lián)合免疫后的GH及IGF-I水平比單一使用DNA疫苗的高。加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對照組(P<0.05)。以CpGDNA為佐劑的免疫組GH水平至第6周達到高峰，顯著高于pES／2SS組(P<0.01)，其中加細菌DNA組峰值最高，達6

9、.65ng／ml，加單鏈CpGDNA組GH高水平持續(xù)時間最長，至免疫后10周，仍顯著高于pES／2SS組(P<0.01)。加CpGDNA組IGF-I值顯著高于不加佐劑的pES／2SS疫苗組(P<0.01)，細菌DNA組峰值最高，達909.72ng／ml。分析第6周所檢測的各免疫組小鼠生長抑素抗體P／N值、GH、IGF-I、及周增重之間的相關(guān)，GH與IGF-I水平顯著相關(guān)(P<0.05)。生長抑素抗體與周增重、GH和IGF-I之間相關(guān)性未

10、達到顯著水平(P>0.05)，r值也接近1(0.696，0.709，0.856)。這些結(jié)果表明：SS基因免疫產(chǎn)生SS抗體，有效中和了內(nèi)源性SS，影響了相關(guān)激素的分泌，而含CpGDNA序列的核酸佐劑以及脂質(zhì)體粗品，可以增強生長抑素基因疫苗的效果，并可影響GH及IGF-I的分泌水平。 4、分子佐劑對生長抑素基因免疫湖羊羔羊的作用及機制研究 選擇60只斷奶湖羊母羔羊，分為6組，在用生長抑素基因融合真核表達質(zhì)粒pES／2

11、SS免疫的同時，分別用pE-CpG質(zhì)粒、細菌DNA、脂質(zhì)體粗品配合作為佐劑，另一組用重新構(gòu)建的pES／2SS-GMCSF免疫。免疫組每只湖羊肌肉接種4 mL含0.4 mg免疫原的稀釋液。對照組每只注射4mL生理鹽水。佐劑按等量與之混合。初次免疫4周后以相同劑量加強免疫一次。ELISA檢測生長抑素抗體水平，雙抗RIA檢測GH及IGF-I水平。結(jié)果顯示，首次免疫4周和加強免疫2周后，細菌DNA佐劑組的抗體水平顯著高于生長抑素單獨免疫組，其抗

12、體陽性率也為免疫各組最高，達50％。全期免疫組抗生長抑素抗體陽性率達36.0％。免疫羊的增重比對照組高18.82％(P<0.01)，最優(yōu)為 pES／2SS+pE-CpG組，其次為pES／2SS+細菌DNA組，分別比對照組高33.0％和31.6％ (P<0.01)，且顯著高于pES／2SS單獨免疫組(P<0.05)。pE8／2SS-GMCSF免疫組比對照 組高21.7％(P<0.05)。加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-I

13、水平顯著高于對照組 (P<0.05)，抗體陽性羊的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)。分析第2、 4、6、10周所檢測的各免疫組湖羊生長抑素抗體P／N值、GH、IGF-1及周增重之間的 相關(guān)，發(fā)現(xiàn)生長抑素抗體與GH、IGF-1、周增重顯著相關(guān)(P<0.01)，周增重與生長抑 素抗體(P<0.01)、GH(P<0.01)、IGF-1(P<0.05)顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明：SS基因免 疫產(chǎn)生SS抗體，有效中和了

14、內(nèi)源性SS，影響了相關(guān)激素的分泌，促進羔羊生長。 5.生長抑素DNA疫苗pES／2SS和pES／2SS-GMCSF免疫湖羊的安全性檢測 應(yīng)用0.4mg pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒對湖羊進行免疫，間隔4周以 相同劑量加強免疫一次。采取羊全血和耳組織，提取血液和組織基因組DNA，用pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒中S基因與Kan抗性基因片段的兩對特異性引物，對 pE

15、S／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒以及所采組織進行PCR擴增，結(jié)果在pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF質(zhì)粒中擴增出一條660bp的s基因片段和一條840bp的Kan抗性 基因的特異性條帶，而所采組織中則沒有擴增出特異性的條帶。因此從基因整合的角 度看，pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒免疫湖羊是安全的。 綜上所述，本研究通過生長抑素基因疫苗pES／2SS聯(lián)合不同佐劑免疫小鼠，發(fā)

16、現(xiàn) 含CpGDNA序列的核酸佐劑，提高了SS DNA疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，并產(chǎn) 生了TH<,1>型免疫佐劑效應(yīng)，增強了生長抑素基因疫苗的免疫效果，雌性小鼠免疫后 4 周、6周，疫苗組平均增重顯著高于對照組(P<0.05)。生長抑素基因免疫湖羊羔羊， 加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對照組(P<0.05)，抗體陽性羊 的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)，免疫羊的增重比對照組高