通過16S rDNA序列分析研究幽門螺桿菌根除療法對腸道菌群的影響.pdf

1、目的和意義: 研究目前國內(nèi)外普遍關(guān)注臨床上大量采用的幽門螺桿菌根除治療方案在腸道微生態(tài)平衡打破方面的作用及其對腸道微生態(tài)的影響。本研究通過16S rDNA基因序列分析觀察質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）、阿莫西林、克拉霉素組成的三聯(lián)療法根除治療幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hpylori）感染對腸道菌群的影響。通過研究三聯(lián)療法根除Hpylori感染對腸道微生態(tài)平衡打破方面的

2、作用及其對腸道微生態(tài)的影響，對于指導(dǎo)臨床用藥，研究新的抗Hpylori感染治療方法以及減少藥物副作用等具有重要意義；同時為構(gòu)建環(huán)境和臨床標(biāo)本中微生物的快速測定基因芯片提供研究基礎(chǔ)。 方法: 1.研究對象; 20-25名志愿者被告知將接受一次13C尿素呼氣試驗，該試驗對機體無任何損害，對Hpylori感染診斷的敏感性和特異性高于90%。這些志愿者均填寫知情同意書并接受一次問卷調(diào)查，合格的志愿者符合下列標(biāo)準(zhǔn)：13C呼

3、氣試驗陽性，且近5周內(nèi)未使用任何制酸劑、益生菌、抗生素或和抗微生物制劑，消化系統(tǒng)無其它器質(zhì)性疾病，消化道未進(jìn)行過手術(shù)活動，無酗酒史，無糖尿病及影響腸道菌群的其它問題。最后共有12名志愿者符合情況，包括8名男性和4名女性，平均年齡為34歲（年齡范圍為23-58歲）。所有的志愿者都填寫了知情同意書。 被13C呼氣試驗證明為H.pylori感染的12名志愿者在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口服給予為期7天的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法（阿莫西林1000m

4、g，2次/天，飯后服；克拉霉素500mg，2次/天，飯后服；雷貝拉唑20mg，2次/天，飯前服），對治療期間出現(xiàn)的藥物副作用詳加記錄。這些志愿者治療期間的飲食習(xí)慣與平常一樣，治療期間所有志愿者不再服用任何制酸劑、益生菌、抗生素，治療結(jié)束后4周復(fù)查13C呼氣試驗評價是否根除成功。 2.標(biāo)本收集; 每個志愿者在接受治療前一天（0天）和一周療法結(jié)束后一天（第8天）各采集糞便10克。采集的糞便與10ml生理鹽水混勻，分裝10支（

5、每支1ml）至1.5ml液氮凍存管于液氮中保存。標(biāo)本采集完全后，運送到中國疾病預(yù)防控制中心傳染病控制所診斷室的實驗室，所有糞便標(biāo)本-72℃保存。 3.細(xì)菌DNA提取; 每份標(biāo)本取0.5ml（約相當(dāng)于0.5g糞便）用GENMED糞便細(xì)菌DNA分離試劑盒自糞便標(biāo)本中提取細(xì)菌總DNA。提取的核酸用紫外分光光度計測定其濃度。 4.PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化; 利用2個通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的全長，PCR

6、擴(kuò)增選用細(xì)菌通用引物序列為：8F（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’），該引物對絕大數(shù)細(xì)菌16S rDNA基因序列具有特異性。PCR反應(yīng)混合液包括0.5μl EXTaq酶（2.5u ml-1，TaKaRa生物，中國大連），5μl10×EXTaq Buffer（plusMg2+），4μl dNTP mixture（各2.5MM），上下游引物（10μmo

7、l/L）各0.5μl，8-Methoxypsoralen（8-MOP）0.5μl（2.5mg/ml），去離子水定容至49μl，將未加模板的混合液在室溫下用紫外線照射后再加1μl模板；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、52℃退火1min、72℃延伸1.5min，共25個循環(huán)；72℃最后延伸5min，陰性對照用去離子水代替模板，擴(kuò)增反應(yīng)在My CyclerTM thermal cycler上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用經(jīng)GelR

8、edTM染色的1%瓊脂糖凝膠電泳（緩沖液為1×TAE buffer）鑒定，圖像用GelDoc凝膠成像儀觀察，1.5kb DNA條帶自凝膠上切下，PCR產(chǎn)物純化按Qiaquick PCR gel extraction kit說明書操作步驟進(jìn)行。 5.16S rDNA克隆文庫的建立和序列分析; 經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體連接，然后按操作說明轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，重組的克隆子在LB瓊脂平皿（包括1

9、00mg/ml的氨芐青霉素，20mg/ml的X-Gal和24mg/ml的IPTG）上生長，每份標(biāo)本隨機挑選100個白色克隆子傳代于含100mg/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37℃培養(yǎng)過夜后，將克隆子送公司測序。短期4℃保存連接后轉(zhuǎn)化克隆平皿，若測序中需補充克隆時，進(jìn)行補充挑選。用CHIMERA-CHECK程序檢測序列中可能出現(xiàn)的嵌合體，每個16S rDNA序列（大約1500bp）同時用GenBank的BLAST和RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，若

10、某個序列在兩個數(shù)據(jù)庫中同時為一類則該序列歸為此類，若某個序列在兩個數(shù)據(jù)庫不匹配則按RDP數(shù)據(jù)庫中最相似的進(jìn)行歸類。 6、統(tǒng)計分析; 治療前和治療后細(xì)菌特征的改變?nèi)缗囵B(yǎng)條件、致病性用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，p<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計軟件使用SPSS11.0。 結(jié)果: 1.治療期間出現(xiàn)的副反應(yīng); 志愿者平常為成形固體便或稍硬便。治療期間未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，最常見的副作用是輕微腹瀉、口苦和輕

11、微腹痛。在三聯(lián)療法治療期間，有10個人出現(xiàn)腹瀉，3個人出現(xiàn)口苦，2個人輕微腹痛，1個人便秘。這些志愿者中有人只出現(xiàn)上述副反應(yīng)中的一種，有人同時出現(xiàn)上述副反應(yīng)的兩種或兩種以上。治療期間未有人中斷治療。 2.根據(jù)16S rDNA克隆文庫分析腸道菌群; 隨機挑選的2400個克隆子的經(jīng)RDP和GenBank數(shù)據(jù)庫比對共檢測到39種細(xì)菌種屬。治療前糞便優(yōu)勢菌屬有Bacteroides spp.，Lachnospiraceae In

12、certae Sedis，Peptostreptococcaceae Incertae Sedis，Ruminococcus spp.，Parabacteroides spp.，F(xiàn)aecalibacterium spp.，Escherichia coli，Roseburia spp.，Alistipes spp.，and Streptococcus spp.。治療結(jié)束后糞便中主要菌屬有Bacteroides spp.，Shigella

13、spp.，Lachnospiraceae Incertae Sedis，Parabacteroides spp.，Escherichia coli.，Klebsiella peneumoniae，F(xiàn)aecalibacterium spp.，Citrobacter spp.，Peptostreptococcaceae Incertae Sedis and Ruminococcus spp。本研究中未檢測到Bifidobacterium s

14、pp.，Lactobacillus spp.，andyeast。與治療前相比，治療后專性厭氧菌明顯下降（X2=51.040，p=0.000），而兼性厭氧菌（X2=190.678，p=0.000）及需氧菌（X2=18.182，p=0.000）則明顯增加。與治療前相比，治療后正常菌群的數(shù)量明顯受到抑制（X2=83.619，p=0.000），而機會致病菌的數(shù)量如E coli and K. pneumoniae明顯增加（X2=124.101，p

15、=0.000），致病菌如Shigella于治療后明顯增加（X2=468.127，p=0.000）。志愿者F于治療后出現(xiàn)Campylobacter jejuni致病菌，治療前未檢測到該致病菌。 結(jié)論: 根除H.pylori感染的三聯(lián)療法可以對12名中國志愿者的腸道菌群產(chǎn)生負(fù)面影響，這主要是因為腸道正常菌群的生態(tài)平衡被打破從而導(dǎo)致機會致病菌和致病菌過度生長使腸道抗定植力減弱。在臨床實踐中進(jìn)行以抗生素為基礎(chǔ)的根除H.pylor

16、i感染治療時應(yīng)該考慮到這方面的問題。本研究成功構(gòu)建了根除HP治療前后腸道菌群的16S rRNA基因克隆文庫。通過16S rRNA序列分析技術(shù)，我們能夠直接使用臨床標(biāo)本，不需要獲得純培養(yǎng)的細(xì)菌，能夠快速檢測和鑒定不能培養(yǎng)的細(xì)菌，鑒定使用常規(guī)方法難以鑒定的細(xì)菌和發(fā)現(xiàn)新的病原菌。16S rRNA序列分析技術(shù)可用于臨床和環(huán)境中微生物的檢測及鑒定，并能夠較好的反映菌群的數(shù)量及多樣性。我們的研究沒有進(jìn)一步證據(jù)證明抗生素根除H.pylori感染后對腸