糖尿病對大鼠牙周組織、白細胞介素-6表達及血清超敏C反應蛋白水平的影響.pdf

1、糖尿病是一種系統(tǒng)性疾病，由于糖類，脂肪代謝不良導致高血糖和高血脂；牙周組織疾病是發(fā)生在牙周支持組織（牙齦、牙周膜、牙槽骨）的一種破壞性疾病，最終會導致牙齒缺失。盡管存在一些爭議，關于糖尿病和牙周組織疾病的一些相關關系已經(jīng)被很多學者報道，因此將牙周組織疾病列為糖尿病的第六大并發(fā)癥，糖尿病和牙周組織疾病之間的雙向關系也成為眾多學者關注的熱點。臨床觀察證明，糖尿病患者牙周疾病患病率增高，嚴重性增加，并且其菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、牙周袋深度、牙周附

2、著喪失及牙槽骨吸收程度均高于健康人，可能是牙周疾病發(fā)展過程中的一個重要的危險因素；動物實驗中，在引入外界刺激因素的情況下，如絲線結扎，菌斑接種等，牙周組織骨喪失在糖尿病大鼠中明顯加重，而無外界刺激因素時糖尿病對大鼠牙周組織的影響尚未見明確詳細報道。本論文主要研究在沒有外界刺激因素的情況下，糖尿病對SD大鼠牙周組織及對炎癥因子如白細胞介素-6和超敏C反應蛋白的影響。 目的： （1）建立2型糖尿病SD大鼠模型； （2

3、）比較不同時間點，正常對照組大鼠和糖尿病模型組大鼠牙周組織情況； （3）比較不同時間點正常組SD大鼠和模型組大鼠頜骨和股骨骨組織X線結構； （4）比較不同時間點光鏡下正常組SD大鼠和模型組大鼠骨組織結構； （5）比較正常組和模型組大鼠骨組織IL-6免疫組織化學結果； （6）比較正常組和模型組大鼠血清超敏C反應蛋白水平。 方法： 1．SD大鼠隨機分為正常對照組和STZ致糖尿病模型組，對照組8

4、只，模型組30只。模型組大鼠高熱量飼料喂養(yǎng)1個月后，造成肥胖模型，然后一次性靜脈注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（55mg/kg體重），以造成糖尿病模型；正常對照組大鼠使用普通飼料喂養(yǎng)1個月后，一次性靜脈注射0．1mol/L，pH4．5相同劑量的檸檬酸緩沖液：監(jiān)測尿糖血糖改變情況，尿糖+++，血糖值≥11．2mmol/L，該指標至少持續(xù)2周的實驗動物作為成功的糖尿病大鼠模型。 分別于實驗開始第6，10，12

5、，16周后，隨機選取大鼠稱取體重，每次對照組取2只，實驗組7只，3%戊巴比妥鈉麻醉，每只大鼠采血5-7ml，3000r/min離心15分鐘，取血清，分裝保存于-70℃超低溫冰箱。取上下頜骨及雙側股骨，一側股骨置于4%福爾馬林液固定備用，另一側置于-70℃低溫冰箱保存。 2．牙周附著情況：大鼠麻醉后，觀察牙齦色、形、質(zhì)改變及牙齦退縮情況，牙周探針探查大鼠牙周情況。 3．骨組織X線觀察：去除頜骨及股骨上的神經(jīng)肌肉，暴露完整的

6、骨組織，在數(shù)字化牙片X光機上拍攝骨組織的X線片，工作條件：電壓63Kv，電流8mA，曝光時間0．080s。 4．骨組織形態(tài)學觀察：經(jīng)4%福爾馬林液固定24小時后，取一半頜骨及一側股骨，口腔科慢速渦輪機沿股骨長軸及頜骨近遠中方向制備成5mm厚的骨塊，將骨塊進行石蠟包埋，股骨標本沿長軸制備5-7um切片，頜骨標本制作為近遠中方向為5-7um的切片，HE染色。 5．大鼠骨組織IL-6免疫組織化學：糖尿病大鼠骨組織石蠟切片按常規(guī)

7、脫蠟復水，雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復，5%牛血清白蛋白封閉后，將IL-6按1：20，1：40，1：80，1：100比例稀釋，37℃恒溫箱孵育一小時左右；加生物素化山羊抗鼠IgG，放于37℃恒溫箱孵育20分鐘；加SABC，37℃恒溫箱孵育20分鐘；DAB顯色5-30分鐘，光鏡下觀察。 6．大鼠血清超敏C反應蛋白的測定：采用免疫散射比濁法，按照說明書編輯參數(shù)，測定結果。正常值為0～1mg/L。

8、結果： 1．從血糖測定結果及尿糖監(jiān)測結果看，SD大鼠靜脈一次性注射鏈脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在整個實驗過程中模型組除2只SD大鼠外，其它動物在給藥后血糖尿糖均有明顯改變，模型組動物在注射鏈脲佐菌素后一周尿糖增高為+++，血糖均高于11．2mmol/L。 2．牙周組織探查結果：整個實驗過程中，正常對照組和模型組大鼠牙齦形狀、質(zhì)地沒有出現(xiàn)明顯異常，未發(fā)現(xiàn)牙齦萎縮，牙周探查深度均維持在初始水平，模型組大鼠后期牙

9、齦顏色輕微發(fā)紅，牙齦出血指數(shù)較對照組稍稍偏高。 3．骨組織X線檢查結果：正常對照組大鼠整個實驗過程牙槽嵴高度無明顯改變，實驗開始至第10周時，對照組和模型組大鼠牙槽骨在X線片上未見明顯異常，牙槽嵴頂白線清晰可見，股骨骨皮質(zhì)稍顯增厚；第12周模型組大鼠牙槽骨及股骨出現(xiàn)骨密度減低區(qū)伴有骨小梁的吸收，X線片呈現(xiàn)透射影像。 4．骨形態(tài)學觀察結果：在整個實驗過程中，對照組大鼠的股骨與頜骨骨皮質(zhì)、骨小梁結構清楚，在鏡下可看到骨小梁走

10、行向各個方向，形態(tài)不一，交織成網(wǎng)；糖尿病大鼠牙槽嵴高度無明顯改變，自第12周可觀察到股骨及頜骨骨吸收活躍，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁變細，HE染色破骨細胞及骨吸收陷窩明顯可見。 測量骨皮質(zhì)厚度和骨小梁數(shù)目，以健康對照組大鼠作為標準進行比較，除第10周外，各組之間均有差異（F=60．729，P=0．000），糖尿病模型組大鼠骨皮質(zhì)厚度第6周與正常組差異性顯著，P值為0．015，開始變?。坏?0周糖尿病模型組大鼠骨皮質(zhì)厚度與正常對照組統(tǒng)計學

11、上無差異（P>0．05），可能是由于骨外膜反應性增厚引起的；第12，16周模型組骨皮質(zhì)厚度與正常組差異性顯著（P均為0．000，P<0．05），與正常對照組相比骨皮質(zhì)變??；糖尿病組大鼠骨小梁數(shù)目在五組之間有差異（F=11．270，P=0．000），第6，12，16周骨皮質(zhì)厚度與正常對照組相比均有差異（P<0．05），骨小梁數(shù)目減少；第6周糖尿病組大鼠骨小梁數(shù)目與正常組統(tǒng)計學上無差異（P=0．135，P>0．05）；第10，12，16周骨

12、小梁數(shù)目與正常組差異性顯著（P分別為0．041，0．001，0．000，P<0．05），骨小梁數(shù)目減少。 5．骨組織IL-6免疫組織化學反應結果：正常大鼠的骨組織IL-6免疫組織化學結果顯示：淡黃色染色彌散顆粒包繞骨小梁和骨髓腔；糖尿病組大鼠整個髓腔內(nèi)，可見黃色染色彌散顆粒包繞骨小梁，與正常組骨組織相比沒有明顯差異，統(tǒng)計學分析無差異。 6．大鼠血清超敏C反應蛋白的測定結果：糖尿病模型組超敏C反應蛋白與正常對照組比較統(tǒng)計學

13、意義顯著，P值為0．000（P<0．01），高于正常對照組，糖尿病模型組大鼠血糖，甘油三酯和正常對照組大鼠相比差異性顯著，P值分別為0．000，0．002（P<0．01），而總膽固醇兩組數(shù)值無統(tǒng)計學意義，P值為0．401（P>0．05），變化不明顯。 結論： 1．SD大鼠靜脈一次性注射鏈脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在給藥后血糖尿糖均有明顯改變，模型組動物在注射鏈脲佐菌素后一周尿糖增高為+++，血糖均高于11．

14、2mmol/L。 2．模型組大鼠和正常對照組在整個實驗過程中，牙周組織改變不明顯，可以認為在沒有外界刺激因素的情況下，糖尿病并不能作為一個單獨的病因引起牙周病。 3．糖尿病模型組和正常對照組大鼠骨組織IL-6免疫組織化學反應差別不大，提示骨組織中IL-6的表達是很少量的。 4．糖尿病模型組大鼠血清中超敏C反應蛋白水平顯著高于正常對照組，急性時相炎癥因子出現(xiàn)，說明機體處于炎癥狀態(tài)，對于牙周組織疾病的發(fā)生是一個危險信