血小板裂解液(platelet lysate,PL)對(duì)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)影響.pdf

1、血小板裂解液（platelet lysate，PL）是自體或異體血小板富集物經(jīng)細(xì)胞裂解后的產(chǎn)物，已經(jīng)被諸多研究推薦作為胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的替代品，應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）的大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)。但是，PL對(duì)諸如牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells

2、，PDLSCs）及根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAP）等牙源性干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。本課題在體外分離、培養(yǎng)和鑒定人牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過比較體內(nèi)、外不同培養(yǎng)模式下，PL對(duì)這三種牙源性干細(xì)胞增殖及分化的影響，以期找到PL應(yīng)用于牙源性干細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化的最佳方式，為研究相關(guān)機(jī)制及組織工程應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為將來PL在臨床治療方面的應(yīng)用提供新的

3、思路。結(jié)果如下。
　　1.牙髓干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　使用酶消化法或組織塊法分離獲得人原代DPSCs、SCAP和PDLSCs，利用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)以純化傳代細(xì)胞；采用免疫細(xì)胞染色及流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞STRO-1等表型，確定所獲細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞屬性；采用成脂誘導(dǎo)及成骨/成牙本質(zhì)誘導(dǎo)驗(yàn)證細(xì)胞的多向分化能力。
　　2.血小板裂解液的制備及相關(guān)培養(yǎng)體系的建立
　　使用10人份機(jī)

4、采血小板，混合后利用凍融裂解法制得滿足實(shí)驗(yàn)需要的血小板裂解液PL；將PL制成品以一定的體積濃度比加入普通培養(yǎng)基及礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制成條件培養(yǎng)液；將擴(kuò)增培養(yǎng)所獲的牙源性干細(xì)胞以平面培養(yǎng)或復(fù)合HA-TCP支架培養(yǎng)，營(yíng)造不同的細(xì)胞培養(yǎng)空間環(huán)境。
　　3.血小板裂解液對(duì)DPSCs、SCAP和PDLSCs體外增殖、礦化的影響
　　以體外二維平面培養(yǎng)或復(fù)合 HA-TCP支架三維培養(yǎng)的DPSCs、SCAP和PDLSCs為靶細(xì)胞，研究不同濃

5、度PL對(duì)牙源性干細(xì)胞增殖及礦化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PL對(duì)DPSCs的增殖、成骨/成牙本質(zhì)分化的干預(yù)效應(yīng)與其在培養(yǎng)體系之中的相對(duì)濃度、細(xì)胞培養(yǎng)的空間模式密切相關(guān)；平面及三維培養(yǎng)模式下，5％PL均能夠顯著促進(jìn)DPSCs的增殖分化（P＜0.05），同時(shí)掃描電鏡及組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，該濃度PL處理組樣本在體外三維培養(yǎng)至第14天時(shí)，能夠形成大量膠原纖維包繞于細(xì)胞膜片-支架材料復(fù)合體表面；而對(duì)于體外三維培養(yǎng)模式下的SCAP和PDLSCs，5％PL同樣

6、能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖及礦化基質(zhì)的形成，并有助于在支架材料上形成完整的細(xì)胞膜片樣結(jié)構(gòu)，且PDLSCs對(duì)于以上效應(yīng)的應(yīng)答更為顯著，同時(shí)SCAP在培養(yǎng)至第7天時(shí)，即形成大量膠原纖維包裹于細(xì)胞膜片-支架材料復(fù)合體表面。
　　4.血小板裂解液對(duì)DPSCs、SCAP和PDLSCs的體內(nèi)組織再生能力的影響
　　體內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：將經(jīng)不同濃度PL體外培養(yǎng)14天的DPSCs/HA-TCP支架復(fù)合體植入裸鼠背部皮下12周后，發(fā)現(xiàn)PL處理組具有更

7、強(qiáng)的體內(nèi)構(gòu)建硬組織能力（P＜0.05），而5％PL能夠顯著提高DPSCs在人離體牙根管腔內(nèi)再生牙體組織的能力；SCAP及PDLSCs經(jīng)不同濃度PL培養(yǎng)后，以細(xì)胞膜片形式復(fù)合HA-TCP支架材料植入裸鼠背部皮下8周后即可分別形成特征性的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)、牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。
　　綜上所述，本研究認(rèn)為一定體積濃度比的PL在DPSCs、SCAP及PDLSCs等牙源性干細(xì)胞體內(nèi)外增殖、定向分化中可能起到促進(jìn)作用，在牙組織工程領(lǐng)域具