炎癥刺激對人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)性能的影響.pdf

1、背景和目的:
　　牙周支持組織(periodontalsupporttissues)主要由兩種軟組織(牙齦和牙周膜)和兩種硬組織(牙槽骨和牙骨質(zhì))。其中,牙齦組織是指覆蓋于牙頸部周圍及牙槽突表面的口腔黏膜上皮及下方的結(jié)締組織,而牙周膜(periodontalligament,PDL)則是連接牙齒和牙槽骨的致密結(jié)締組織,對牙齒的穩(wěn)固和功能起著不可或缺的作用。近年來越來越多的研究表明,牙周膜組織中也存在未分化的、具有自我更新和多向分化

2、潛能的細(xì)胞,一般稱為牙周膜干細(xì)胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs),這些細(xì)胞是牙周支持組織再生和重建的基礎(chǔ)。因此,在牙周組織破壞的病理?xiàng)l件下,利用體外培養(yǎng)擴(kuò)增的干細(xì)胞(如PDLSCs或其他牙源性組織來源的干細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞移植,有望解決牙周再生面臨的困難和挑戰(zhàn),具有重要的臨床意義。
　　雖然牙周干細(xì)胞治療首選PDLSCs,但PDLSCs取材困難,來源有限,大大限制了其臨床應(yīng)用的潛能。而同屬牙周

3、支持組織的牙齦組織,取材容易、方便,取材后組織愈合快、能夠無疤愈合,如能從牙齦組織中獲得具有牙周組織再生能力的干細(xì)胞,將極大推動干細(xì)胞治療牙周病的臨床轉(zhuǎn)化潛能。現(xiàn)有研究證實(shí),人牙齦組織中的確存在具有自我更新、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用的干細(xì)胞,一般稱為牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)。雖然體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)GMSCs具有良好的形成軟硬組織的能力,GMSCs是否可以作為PDLSCs的代

4、替細(xì)胞,用于牙周病的治療,還需要進(jìn)一步深入研究。
　　為探討GMSCs用于牙周組織工程的可行性,我們首次將GMSCs和PDLSCs的基本生物學(xué)性能進(jìn)行系統(tǒng)的對比研究分析;同時(shí)考慮到利用干細(xì)胞進(jìn)行牙周治療的過程中,植入的干細(xì)胞將面臨一個具有大量炎性因子存在的微環(huán)境(牙周炎微環(huán)境),本實(shí)驗(yàn)中,我們進(jìn)一步體外模擬牙周炎的炎癥微環(huán)境,觀察兩種干細(xì)胞對炎性刺激的反應(yīng),為GMSCs用于牙周再生治療的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:

5、　　第一部分:GMSCs與PDLSCs的培養(yǎng)、鑒定和生物學(xué)性能的對比分析
　　來源于同一個體的正常牙齦和牙周膜組織進(jìn)行配對細(xì)胞的原代培養(yǎng),通過低密度接種法獲得GMSCs和PDLSCs;采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測,繪制細(xì)胞生長曲線及計(jì)算克隆形成率,比較兩種干細(xì)胞的增殖能力;進(jìn)一步通過成骨、成脂、成軟骨能力的對比觀察和定量分析,通過RT-PCR對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測,綜合比較兩種干細(xì)胞的生物學(xué)性能。
　　第二部分:

6、炎性刺激對兩種細(xì)胞分化和體內(nèi)骨形成能力的影響
　　以IL-1β(5ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)兩種炎性因子構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境;觀察比較體外炎癥微環(huán)境中兩種干細(xì)胞的分化能力的影響。采用茜素紅染色、ALP染色、ALP定量及實(shí)時(shí)定量PCR等方法,比較兩種干細(xì)胞在炎癥環(huán)境下成骨、成脂能力的改變及炎癥刺激對干細(xì)胞性能影響的程度;最后,將正常與炎癥環(huán)境下成骨誘導(dǎo)的GMSCs與PDLSCs膜片分別與骨支架材料復(fù)合,植入裸鼠背部皮下

7、,8周后切片染色,觀察比較兩種干細(xì)胞在不同環(huán)境下經(jīng)誘導(dǎo)后異位骨形成能力。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　1、原代細(xì)胞經(jīng)單細(xì)胞克隆獲得相對純化的干細(xì)胞,細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測顯示兩種組織來源的干細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1、CD146、CD105、CD90、CD29表達(dá)均呈陽性,而對造血系標(biāo)志物CD45和內(nèi)皮系標(biāo)志物CD31表達(dá)均呈陰性。兩種細(xì)胞的干細(xì)胞表型相似,無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　2、兩

8、種干細(xì)胞的生長曲線和克隆形成率配對比較:GMSCs的增殖能力明顯強(qiáng)于PDLSCs(P<0.05)。
　　3、體外成骨、成脂、成軟骨能力比較及相關(guān)基因表達(dá)檢測顯示,兩種干細(xì)胞均具有較強(qiáng)的分化能力,PDLSCs成骨能力和成軟骨能力要顯著高于GMSCs(P<0.05);而GMSCs的成脂能力要強(qiáng)于PDLSCs,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　第二部分:
　　1、兩種干細(xì)胞的體外成骨能力在炎癥刺激下均受到顯著性抑制(P<

9、0.05),且PDLSCs成骨能力抑制程度相對GMSCs更為明顯(P<0.01)。
　　2、兩種干細(xì)胞的成脂能力在炎癥刺激下也都受到不同程度抑制,但抑制作用經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,無顯著性差異(P>0.05)。
　　3、兩種細(xì)胞經(jīng)炎癥刺激后,植入裸鼠皮下,8周后骨形成定量分析結(jié)果顯示:炎癥刺激后,兩種細(xì)胞異位骨形成能力均顯著降低(P<0.05);PDLSCs成骨能力受到的影響與GMSCs相比,更為明顯(P<0.01)。
　　結(jié)論

10、:
　　牙齦和牙周膜組織中均存在著大量的間充質(zhì)干細(xì)胞,這些間充質(zhì)干細(xì)胞均具有良好的成骨、成脂及成軟骨的特性,并具有較強(qiáng)的異位成骨能力。在正常培養(yǎng)條件下,PDLSCs相比GMSCs具有更好的骨向分化潛能,但其來源有限,大大限制了進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。而GMSCs來源廣泛,具有和骨髓、牙周膜及其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特性及免疫調(diào)節(jié)能力。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),在炎癥刺激下GMSCs和PDLSCs的骨向分化能力都有下降,但是GMSCs受炎