富血小板血漿凝膠的制備及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、富血小板血漿含有高濃度多種生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖、移動(dòng)、分化以及膠原蛋白合成、刺激血管化的作用。但由于富血小板血漿所包含的生長(zhǎng)因子眾多，互相之間的作用機(jī)制難以盡述，加之富血小板血漿的制作方法不同，各種方法所得富血小板血漿中血小板含量、激活率不同，所含生長(zhǎng)因子濃度不同。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)富血小板血漿的作用看法不盡一致。 目的：抽取比格犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并分離純化后，采用3種不同方法制備富血小板血漿，觀察血小板濃度及活化率，

2、以選擇合適的制作方法。PRP加入激活劑制成凝膠，分析其生物相容性，觀察不同濃度富血小板血漿凝膠對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。 方法：首先抽取比格犬骨髓，采用密度梯度離心法取密度為1.079±0.002g/ml的Percoll液分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)貼壁生長(zhǎng)法培養(yǎng)、擴(kuò)增并純化細(xì)胞后流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表型，MTT法測(cè)定3、5、10代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，成軟骨及成骨誘導(dǎo)檢測(cè)其多向分化能力；按照Landesberg法，Aghaloo法及

3、改良兩步離心法3種不同方法制備PRP，測(cè)定血小板濃度、回收率及CD62P表達(dá)率。再將PRP與激活劑反應(yīng)形成凝膠，人工計(jì)數(shù)細(xì)胞黏附率，MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性；將不同濃度PRP凝膠作用于BMSCs，MTT法觀察細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度，分析PRP對(duì)BMSCs的增殖效應(yīng)及最佳的濃度。 結(jié)果：犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心法聯(lián)合貼壁生長(zhǎng)法分離、純化、擴(kuò)增，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，增殖明顯，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳5代細(xì)胞有96％表達(dá)CD44，95％表達(dá)CD

4、29，而只有5％表達(dá)CD34，并可多向分化，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征。比較3種PRP制作方法，改良兩步離心法血小板回收率較高而CD62P表達(dá)率相對(duì)較低。故以改良兩步離心法相對(duì)較好。PRP可在早期顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，其增殖強(qiáng)度與PRP濃度相關(guān)，低濃度組(5％、6.25％、7.5％)普遍取得較佳的增值效應(yīng)，其最大增殖度出現(xiàn)在6.25％組；而8.75％、10％后期(10d～14d)細(xì)胞增殖均減緩而進(jìn)入平臺(tái)期。 結(jié)論：1