大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導成骨TGF-β信號傳導機制的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(botle mesenchymal stem cells，BMSCs)，又稱骨髓基質(zhì)干細胞，是存在于骨髓基質(zhì)中的一種干細胞，具備干細胞的兩個重要特征：強的自我增殖能力和多向分化潛能，具有向骨、軟骨、成纖維、脂肪、肌肉(心肌)及神經(jīng)細胞等組織分化的潛能。 由于BMSCs具有取材方便，不存在免疫排斥問題，誘導分化的組織類型廣泛等顯著優(yōu)點，因此受到普遍重視，臨床應用前景極為廣闊。1999年，Pittenger 等利用

2、地塞米松、β-磷酸甘油等將體外培養(yǎng)的BMSCs成功誘導分化為成骨細胞，后人又在此基礎上，利用組織工程學的原理，將誘導分化的細胞與載體結合，并成功的在動物體內(nèi)異位成骨。隨后，大規(guī)模的成骨誘導研究相繼展開。 骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF—β)超家族中的成員，研究已顯示，BMP-2具有良好的

3、異位誘導成骨作用，經(jīng)BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs具有明顯增強的成骨轉(zhuǎn)化作用。盡管目前對BMP-2誘導成骨的機理還未完全闡明，但多數(shù)學者認為：BMP-2自身既可以促進BMSCs向成骨細胞及成軟骨細胞分化，同時又可以促進其它成骨因子在誘導成骨中的表達，從而增強誘導成骨作用。 全反式維甲酸(all-trans—retinoic—acid，ATRA)，是維生素A在機體內(nèi)的氧化代謝產(chǎn)物，是一種脂溶性小分子，通過與細胞核上的兩種受體結合，

4、對多種細胞及組織的形態(tài)發(fā)生、增殖分化、生長發(fā)育、代謝及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面具有廣泛的牛物學作用。臨床應用發(fā)現(xiàn)，雖然ATRA對多種惡性腫瘤具有增殖抑制和誘導分化的作用，但同時也有致骨質(zhì)疏松的副作用，這說明ATRA對骨代謝也有調(diào)節(jié)作用。研究己顯示：ATRA對體外培養(yǎng)的BMSCs具有誘導作用：可誘導BMSCs分化出神經(jīng)元樣細胞和脂肪樣細胞。由此我們推測ATRA對誘導成骨的BMSCs肯定也會存在相關的調(diào)節(jié)作用。如何提高BMSCs誘導分化成骨的能

5、力是目前研究的主要方向，本實驗我們進行了：1，大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)及誘導成骨；2，BMSCs體外誘導成骨機制的研究；3，BMSCs裸鼠體內(nèi)誘導成骨的研究，目的是通過這些研究幫助我們認識大鼠BMSCs在各種不同培養(yǎng)基及誘導藥物的作用下向成骨分化的能力以及TGT-β傳導通路在誘導成骨中的作用。 目的： 1.研究在不同誘導條件下BMSCs誘導成骨的作用。 2.應用RT—PeR，研究TGF—β信號傳導通路中各相關

6、基因在BMSCs誘導成骨過程中的變化，從而了解BMSCs誘導成骨的機制。 3.建立動物模型，評估BMSCs與載體結合后的異位成骨能力。 材料和方法： 1.Wistar大鼠20只，取其雙側(cè)股骨脛骨，用全骨髓貼壁法進行大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)條件下(對照組、骨誘導培養(yǎng)基、BMP-2、ATRA)，觀察BMSCs誘導成骨過程中的生長特性； 2.誘導后在不同時間點對ALP、骨標志物以及TGF—β信號

7、通路各基因表達進行檢測； 3.以骨粉為載體，結合BMSCs，隨機分組后植入6只裸鼠皮下飼養(yǎng)8周，觀察生長情況，8周后取出，通過大體觀察、X—ray、組織學觀察等方法評估其成骨能力。 結果： 1.本研究成功地應用全骨髓貼壁法在體外分離培養(yǎng)出大鼠BMSCs，細胞生長良好、增殖能力強、具有多向分化潛能。細胞生長曲線顯示：骨誘導培養(yǎng)基OM、BMP-2及ATRA均可不同程度抑制BMSCs牛長；堿性磷酸酶結果提示：OM及OM

8、+BMP-2組ALP第6天即出現(xiàn)峰值，而CM、CM+BMP-2、CM+ATRA及0M+ATRA四組ALP表達升高則延期；鈣結節(jié)染色證實：CM組及CM+ATRA組不能誘導成骨，而在CM+BMP-2、OM、OM+BMP-2、OM+ATRA四組可見到黑色鈣結節(jié)分布，其中OM+BMP-2中形成的鈣結節(jié)最多，而且鈣結節(jié)顆粒大，密度高，折光性強，染色深，提示誘導成骨作用明顯增強，而OM+ATRA形成的鈣結節(jié)很少且形態(tài)甚微，染色較淺，不易辨別，提示誘

9、導成骨作用明顯抑制。脂滴染色結果證實：BMSCs經(jīng)ATRA單獨誘導可以分化為脂肪細胞。 2.應用RT—PCR檢測TGF—β信號通路中多個基因在不同誘導條件下的表達發(fā)現(xiàn)：BMPr-Ⅰ、BMPz—Ⅱ、SMAD-5及MSX-2等基因在各組中表達有較明顯差異，提示這幾個基因表達的改變可能與不同的誘導成骨機制有關。而在ATRA兩組中，兩利BMPr及SMAD-5的表達均受到明顯抑制。 3.動物實驗結果證明：單純細胞組和單純的骨粉組均

10、不能成骨，而OM+骨粉組和CM+骨粉組均可以誘導成骨。OM+骨粉組的誘導成骨能力明顯強于CM+骨粉組。 結論： 1.在不同誘導培養(yǎng)條件下，BMSCs具有向不同細胞分化的潛能，BMP-2可促進OM誘導成骨的作用，ATRA單獨作用時可以誘導BMSCs分化為脂肪樣細胞，但不能誘導成骨。 2.BMP-2通過上調(diào)BMPr-Ⅰ和SMAD-5的表達量，同時調(diào)整BMPr-Ⅱ和SMAD-5的表達時空順序，使二者峰值提前表達，從而實