成骨生長肽及其誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化機制的研究.pdf

1、成骨生長肽(OsteogenicGrovvthPeptide，OGP)是組蛋白H4基因編碼的一種多肽。研究表明，OGP具有廣泛的成骨和造血活性。體內(nèi) OGP可以刺激骨形成，增加小梁骨密度，促進骨折的愈合：體外OGP可以調(diào)節(jié)多種成骨細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，提高堿性磷酸酶活性，促進基質(zhì)礦化。OGP還可以刺激造血細胞的生成，提高骨髓移植的成活率，OGP的造血活性與OGP改善了造血微環(huán)境有關(guān)。推測OGP的成骨和造血活性可能與骨髓問充質(zhì)干細

2、胞有關(guān)。 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是骨髓中一類具有多向分化潛能的干細胞，足骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在適當?shù)臈l件下可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)成造血細胞生長、分化必不可少的微環(huán)境，同時也是成骨祖細胞的前體細胞，對骨髓造血和成骨均具有十分重要的作用。 為了研究OGP的生物學活性與骨髓間充質(zhì)干細胞的關(guān)系及可能的應(yīng)用前景，本論文從以下幾個方面作了研究： (1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細

3、胞(rBMSCs)的分離培養(yǎng)及OGP對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的作用。結(jié)果表明，OGP在低濃度(10-10mol/L、10-11mol/L)時對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞具有有絲分裂原活性，高濃度(10-8mol/L、10-9mol/L，)時促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。RT-PCR結(jié)果及基因芯片結(jié)果均表明，OGP促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的早期可能與成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfal無關(guān)；OGP誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

4、的早期，成骨細胞特異性表達的標志分子骨鈣素(Osteocalcin)表達陰性，表明大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞還沒有完成向成骨細胞的分化。 (2)成骨生長肽誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞基因表達譜變化的研究。通過博奧27K Rat Genome Array芯片，研究了OGP誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞早期基因表達譜的變化。發(fā)現(xiàn)共有145個差異表達的基因，其中91個上調(diào)表達的基因，54個下調(diào)表達的基因。差異表達的基因中可能與成骨及造血活性相關(guān)的基因

5、共有35個：包括4個血管發(fā)生相關(guān)的基因、9個骨代謝相關(guān)的基因、14個炎癥與免疫相關(guān)的基因、8個細胞增殖與分化相關(guān)的基因?；虮磉_譜芯片結(jié)果為進一步研究OGP促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨和造血活性的分子機制建立了很好的基礎(chǔ)。 (3)重組載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及其成骨分化活性與成骨生長肽誘導的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化活性的比較。以pEGFP-N1質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建了OGP正義載體和Pre-OGP反義載體，并成功的轉(zhuǎn)染了大鼠

6、骨髓間充質(zhì)干細胞。熒光觀察表明，重組載體可以成功地轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。堿性磷酸酶(ALP)活性測定表明，Pre-OGP反義載體轉(zhuǎn)染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化活性受到抑制，而OGP正義載體轉(zhuǎn)染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞更易于成骨分化。 (4)成骨生長肽免疫學檢測方法的建立。為了研究OGP與骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病、骨折延遲愈合和骨折不愈合等臨床疾病的關(guān)系，本論文建立了一種OGP的免疫學檢測方法。通過改進的免疫學方法建立了一種可用