硫糖肽的制備及其抗胃潰瘍的活性研究.pdf

1、胃潰瘍(gastriculcer，GU)指胃內(nèi)受胃液、胃酸和胃蛋白酶調(diào)節(jié)范圍的黏膜層、黏膜下層，甚至肌層和漿膜在多種因素的影響下發(fā)生的局限性組織缺損性疾病。其主要特點是容易復發(fā)，難于防止，因此提高潰瘍愈合質(zhì)量是治愈GU的關鍵因素。近年來研究表明潰瘍愈合質(zhì)量與修復受損黏膜密切相關，GU的愈合不僅要求黏膜表面的修復，下層的修復更為重要。通過對GU發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)抗炎和胃腸粘膜保護已經(jīng)成為GU治療的重要原則。
　　 黏多糖類物質(zhì)作為

2、構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一，參與許多重要的生理活動，其獨特的生物活性已成為生物化學和醫(yī)學領域的研究熱點。目前發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的糖類已有上百種，對其結(jié)構(gòu)和功能的研究越來越深入，其中黏多糖類廣泛的抗炎活性引起人們的重視，且其作用機制多樣，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾后的糖類衍生物，由于其結(jié)構(gòu)的改變，生物活性也有顯著的增強。
　　 鑒于此，本實驗采用硫糖肽為研究對象，以豬十二指腸為原料提取糖肽，經(jīng)磺化修飾制備硫糖肽；并進行處方優(yōu)化，在此基礎以豬十二

3、指腸類肝素為原料開辟制備硫糖肽的新途徑，制備硫糖肽類物質(zhì)；用大鼠胃潰瘍模型進行抗胃潰瘍活性篩選，并對活性硫糖肽進行分離純化，測定其分子量；為比較硫糖肽的藥理活性與其糖鏈部分的關系，采用酶解法將硫糖肽中的糖鏈釋放出；為研究硫糖肽的抗炎和抗?jié)兓钚裕緦嶒炘隗w外檢測了硫糖肽及其糖鏈對大鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-a和IL-4的作用，并在體內(nèi)考察硫糖肽對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用。本研究取得的結(jié)論有以下幾個方面：
　　 1糖肽的提取制備

4、及磺化工藝優(yōu)化豬十二指腸經(jīng)過脫脂、酶解和離子交換純化得到粗品糖肽，運用強陰離子交換樹脂交換吸附雜質(zhì)，精制糖肽，收率為0.96％～1.17％，比文獻報道的0.5％～0.66％提高將近一倍。醋酸纖維素薄膜電泳鑒定產(chǎn)物較為純凈，利用苯酚-硫酸法測定其總糖含量為(22.47±1.41)％，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定糖肽蛋白含量為(14.15±1.06)％。糖肽采用三種磺化方法進行化學修飾，產(chǎn)物表示為SG。通過三種方法的優(yōu)劣比較，確定采用氯磺酸

5、-甲酰胺法，進而設計反應溫度、反應時間、氧化除氨pH三個因素考察在此條件下四個水平的工藝路線，設計正交試驗進行處方優(yōu)化，以產(chǎn)物硫酸基團和總糖含量作為檢測指標，篩選出磺化最佳工藝為氯磺酸-甲酰胺法，反應溫度23℃，反應時間8h，氧化除氨pH9.5。采用最佳工藝磺化三個批次的類肝素產(chǎn)品，產(chǎn)物以HPS-1，HPS-2，HPS-3表示，探索制備硫糖肽的新途徑。各批次磺化產(chǎn)物產(chǎn)物采用超濾脫鹽，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度。
　　 2具有抗胃

6、潰瘍作用的活性硫糖肽的篩選及分離純化無水乙醇灌胃處理大鼠，建立大鼠胃潰瘍模型，以潰瘍指數(shù)、病理切片為檢測指標，從四種磺化產(chǎn)品中篩選出具有抗胃潰瘍活性的硫糖肽SG和HPS-1。結(jié)果表明硫酸基團和總糖含量較高者，抗胃潰瘍活性為強。QFF強陰離子交換層析色譜對活性硫糖肽進行分離純化，得到不同離子強度的硫糖肽組分SG-1、SG-2、SG-3、SG-4、SG-5以及HPS-1-1、HPS-1-2。
　　 3硫糖肽中糖鏈的釋放及硫糖肽分子量

7、的測定采用酶解法釋放出活性硫糖肽中的糖鏈，產(chǎn)物分別為S-1和H-1。紫外掃描光譜技術(shù)(UV)考察硫糖肽及其糖鏈的特征吸收情況，結(jié)果顯示硫糖肽中含有多糖和氨基酸組分，而糖鏈中僅有多糖。運用多角度激光散射技術(shù)確定活性硫糖肽各組分的重均分子量Mw，其中SG和HPS-1分子量分別為99.54kDa和33.97kDa。
　　 4硫糖肽各組分及糖鏈部分對大鼠腹腔巨噬細胞生長因子的影響利用貼壁純化法培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細胞，采用臺盼藍拒染實驗和M

8、TT實驗測定硫糖肽各組分及其糖鏈部分對巨噬細胞的細胞活力的作用，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定大鼠腹腔巨噬細胞上清液中TNF-a和IL-4的含量。結(jié)果顯示硫糖肽糖鏈及其組分對巨噬細胞表現(xiàn)為細胞抑制作用，隨著濃度升高，抑制作用更加明顯，抑制作用最明顯的為SG-4，其在10μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL不同濃度下對巨噬細胞的抑制率分別為（1.69±0.32）％、（4.31±0.43）％、(6.16±0.

9、37)％、（8.71±0.82）％。通過硫糖肽對TNF-a和IL-4表達的抑制作用，篩選出療效較好的組分：SG-3、SG-4，其中RatTNF-a在SG-3濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中的含量307.40±25.71pg/mL和230.59±24.42pg/mL，SG-4濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中RatTNF-a的含量為243.55±4.18pg/mL和207.18±35.68pg/mL，明顯低于模型

10、組508.09±30.53pg/mL，RatIL-4在SG-3濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中的含量54.981±.03pg/mL和46.43±0.55pg/mL，SG-4濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中RatIL-4的含量為49.981±.68pg/mL和43.40±1.20pg/mL，明顯低于模型組73.43±4.54pg/mL。初步證實硫糖肽各組分及其糖鏈部分對巨噬細胞分泌前炎癥細胞因子有抑制作用。

11、r>　　 5SG-3和SG-4對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用采用改良Okabe法建立大鼠胃潰瘍模型，考察SG-3和SG-4對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用。潰瘍組織HE染色顯示不同濃度的SG-3和SG-4均能治療大鼠胃潰瘍?？疾炝肆蛱请膶aspase3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1的表達情況。治療16d后，高劑量的SG-4對上述指標的的表達作用分別是：caspase3抑制率為(81.22±1.62)％，EGFR增長2.25±0

12、.11倍，NO下降至(34.55±2.38)μmol/L，cNiOS增加至(8.43±0.84)U/mL，iNOS下降至(6.81±1.99)U/mL，EGF增加至(35.49±2.67)pg/mL，ET-1下降至(6.31±0.32)pg/mL，與模型組相比具有顯著差異，并與劑量成正相關，隨治療時間和劑量增加而表現(xiàn)明顯的改善作用。通過四個給藥組對胃潰瘍大鼠Caspase3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1表達的顯著改善效果，證