抗EGFR納米抗體的制備及其活性研究.pdf

1、抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的納米抗體由于具有相比普通單克隆抗體更優(yōu)異的溶解性、穩(wěn)定性、滲透性和易于融合表達并且獲得多價抗體等優(yōu)點，在腫瘤的臨床診斷和治療方面具有重要的潛在應用價值。然而，大規(guī)模獲得有活性的抗EGFR納米抗體仍然是目前研究中的難點，是其廣泛應用的重要制約因素。本研究通過進行基因序列改造、誘導表達和分離純化獲得了高純度的5種抗EGFR納米抗體的包涵體，隨后

2、通過優(yōu)化包涵體的復性條件顯著提高了納米抗體的產(chǎn)率。又通過綜合評價復性納米抗體的結(jié)合活性和癌癥細胞表面受體識別能力證實了獲得的納米抗體具有高活性。論文的研究內(nèi)容包括:
　　(1)抗EGFR納米抗體的誘導表達:通過基因工程技術，在大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) BL21(DE3)中進行了5種抗EGFR納米抗體的原核表達。通過比較誘導劑IPTG的加入濃度，加入時間及誘導時間，最終確定納米抗體的最佳表達條件為37

3、℃，IPTG加入時間為菌種開始培養(yǎng)4h后，加入量為0.4 mM，誘導表達4h，最終可使抗EGFR納米抗體的表達量占總蛋白的25％。通過SDS-PAGE進行目的蛋白的可溶性檢測得知，表達的納米抗體主要以包涵體形式存在。
　　(2)抗EGFR納米抗體的分離純化及包涵體復性:本研究通過在抗EGFR納米抗體C端加入6個His標簽，并使用金屬離子螯合層析法，梯度增強咪唑濃度(100 mM咪唑、300 mM咪唑)洗脫，顯著提高了抗EGFR納米

4、抗體的純度，5種納米抗體的最終純度均在90％以上。通過使用Bradford法和細胞Elisa對透析復性和稀釋復性的可溶性蛋白收率和納米抗體活性進行了比較評價，最終采用稀釋復性的方法，并進一步對影響稀釋復性的6種參數(shù)（初始蛋白濃度、稀釋液滴加速率、復性pH、添加劑種類、精氨酸濃度、還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比例）進行考察，確定最佳的稀釋復性條件為:初始蛋白濃度0.3-0.4 mg/mL，復性pH=8.0，添加200 mM精氨酸及比例為

5、5∶1的還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽，包涵體復性率為73％，納米抗體最終得率為38％。
　　(3)抗EGFR納米抗體活性評價及作用靶點研究:本研究通過使用細胞Elisa的方法評價了所獲得的5種納米抗體的結(jié)合活性，最終確定所獲得的5種抗EGFR納米抗體均具有抗原結(jié)合活性，并且納米抗體C活性最高。進一步通過間接免疫熒光技術和MTT法確認了所獲得抗EGFR納米抗體能夠識別表皮癌細胞A431表面EGFR受體，并且能夠與EGF競爭結(jié)合EG