CAT-1作為一種新的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)了內(nèi)皮完整性和L-arginine轉(zhuǎn)運(yùn).pdf

1、心腦血管疾病如冠心病、高血壓、腦卒中、肺動(dòng)脈高壓等是人類(lèi)健康的主要?dú)⑹?。尋找其有效的干預(yù)措施，是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的迫切需求。該組疾病病因復(fù)雜，大多由遺傳及環(huán)境等多因素所致，但內(nèi)皮完整性受損和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是該組疾病發(fā)生的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　內(nèi)皮細(xì)胞連接是內(nèi)皮完整性的分子基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮了重要的作用。在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞連接對(duì)于許多生物功能是必需的，如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和遷移。超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞有三種類(lèi)

2、型細(xì)胞連接，即間隙連接(GJs)、緊密連接(TJs)和粘附連接(AJs)。相鄰細(xì)胞之間的GJs可以形成跨膜通道，而TJs和AJs則通過(guò)跨膜同嗜性粘附作用沿細(xì)胞邊緣形成細(xì)胞外拉鏈結(jié)構(gòu)。在三種內(nèi)皮細(xì)胞連接中，AJs是其主要類(lèi)型，鈣粘蛋白(cadherins)和連接素(nectins)是已知的AJs之一。然而，針對(duì)這些已知分子的干預(yù)措施并不能完全阻斷上述病理狀態(tài)下的內(nèi)皮通透性增加及完整性受損。
　　CAT-1分子家族的第一個(gè)成員（小鼠C

3、AT-1，mCAT-1）最初被鑒定為莫洛尼鼠白血病病毒受體(MuLVR)。氨基酸序列同源比較及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)驗(yàn)揭示CAT-1亦是一種鈉離子依賴的陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而介導(dǎo)了陽(yáng)離子氨基酸如L-arginine(L-Arg)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。L-Arg是細(xì)胞NO合成的唯一前體物質(zhì)，在內(nèi)皮細(xì)胞中CAT-1作為L(zhǎng)-Arg的主要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過(guò)介導(dǎo)胞外L-Arg的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)從而增加內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生濃度。NO是一多功能生物活性分子，它通過(guò)調(diào)節(jié)血管

4、平滑肌張力、抑制白細(xì)胞及血小板與血管內(nèi)皮粘附、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生及向內(nèi)膜遷移，在維持血管生理功能中發(fā)揮重要作用。另外，NO通過(guò)調(diào)節(jié)多種血管介質(zhì)影響血管內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié)，過(guò)量表達(dá)NO后會(huì)增加內(nèi)皮通透性。
　　最近研究顯示，CAT-1在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，比如其過(guò)表達(dá)可以緩解氧化應(yīng)激性內(nèi)皮病理過(guò)程和肥胖導(dǎo)致的高血壓等。但是，CAT-1對(duì)于血管內(nèi)皮完整性的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于過(guò)表達(dá)CAT-1可以增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成

5、，而過(guò)量產(chǎn)生的NO又會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，因此我們猜想CAT-1過(guò)表達(dá)會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性、損傷內(nèi)皮完整性。但是，根據(jù)我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CAT-1過(guò)表達(dá)增加了NO的生成，但是并沒(méi)有增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，相反，降低CAT-1表達(dá)后反而增加內(nèi)皮通透性。因此，內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1可能通過(guò)一種不依賴于NO的其他機(jī)制參與了內(nèi)皮穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，比如穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接等。因此，本課題旨在通過(guò)構(gòu)建CAT-1/GFP融合蛋白，研究CAT-1通過(guò)何種機(jī)制維持了內(nèi)皮通

6、透性。
　　目的:
　　1、構(gòu)建CAT-1/GFP融合表達(dá)蛋白，并評(píng)價(jià)該融合蛋白是否具有野生型CAT-1相一致的生物學(xué)功能;
　　2、分析CAT-1是否通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接維持了內(nèi)皮的完整性;
　　3、驗(yàn)證CAT-1是否具有細(xì)胞粘附分子的生化特點(diǎn)及功能特征;
　　4、探討CAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)底物L(fēng)-Arg對(duì)其發(fā)揮氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞連接功能的影響。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.利用PCR方法

7、從內(nèi)皮細(xì)胞克隆獲取CAT-1基因序列，將基因片段亞克隆至pENTR1 A/GFP穿梭質(zhì)粒形成CAT-1/GFP融合基因穿梭載體，然后采用Gateway LR重組技術(shù)構(gòu)建獲得腺病毒載體pAd-CAT-1/GFP和慢病毒載體pLenti-CAT-1/GFP，分別轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞和293FT細(xì)胞生產(chǎn)病毒，最后感染PAEC細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞建立過(guò)表達(dá)CAT-1的細(xì)胞模型;
　　2.CAT-1/GFP腺病毒感染豬肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)

8、，采用同位素方法檢測(cè)L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)和NO生成，評(píng)價(jià)CAT-1/GFP融合蛋白是否具有野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能;
　　3.活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察CAT-1在PAEC細(xì)胞的表達(dá)及亞細(xì)胞定位;
　　4.Western blot用以檢測(cè)CAT-1/GFP的單體-二聚體(mono-dimer)形式;蛋白交聯(lián)劑BS3處理CHO-S懸浮細(xì)胞，并通過(guò)Western blot檢測(cè)CAT-1二聚體形式是反式（trans）還是順式（cis

9、）結(jié)合;
　　5.建立穩(wěn)定表達(dá)CAT-1/GFP融合蛋白的CHO-S細(xì)胞系，采用細(xì)胞凝集反應(yīng)檢測(cè)CAT-1是否具有促進(jìn)細(xì)胞同源粘附的功能;
　　第二部分:
　　1.利用伊文氏藍(lán)-白蛋白(EB-albumin)作為示蹤劑，單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)用以分析CAT-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響;
　　2.活體細(xì)胞共聚焦顯微鏡分析L-Arg處理對(duì)CAT-1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞連接及其亞細(xì)胞定位的影響。
　　結(jié)果:
　　第

10、一部分:
　　1、酶切鑒定及序列測(cè)序分析證實(shí)CAT-1克隆序列以及CAT-1/GFP融合表達(dá)基因正確無(wú)誤，并且成功包裝了腺病毒和慢病毒;
　　2、CAT-1/GFP融合蛋白具有與CAT-1一致的生物學(xué)功能
　　成功提取并培養(yǎng)了PAEC細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及第八因子抗原染色（Ⅷ-R Ag），細(xì)胞純度大于95％; PAEC細(xì)胞過(guò)表達(dá)CAT-1/GFP后，與表達(dá)GFP對(duì)照細(xì)胞比較，其L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加了9倍(P＜0.01)

11、，NO生成水平升高了5倍(P＜0.01)，說(shuō)明重組的CAT-1/GFP融合蛋白具有與野生型CAT-1一致的功能;
　　3、CAT-1蛋白主要定位在內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接部位
　　PAEC細(xì)胞表達(dá)CAT-1/GFP，利用共聚焦顯微鏡通過(guò)綠色熒光可以發(fā)現(xiàn)CAT-1/GFP主要定位在細(xì)胞-細(xì)胞連接部位，細(xì)胞核周?chē)臒晒獗硎拘律傻牡鞍?CAT-1/GFP表達(dá)水平在48-72h達(dá)到高峰，可以維持至少7d;同時(shí)，免疫細(xì)胞熒光染色證實(shí)野生型

12、CAT-1也有細(xì)胞-細(xì)胞連接部位的定位。提示CAT-1可能是一種細(xì)胞粘附分子。
　　4、CAT-1蛋白具有反式同源二聚體的特點(diǎn)
　　采用4-20％ SDS-PAGE梯度分離膠分析蛋白樣品，可見(jiàn)CAT-1/GFP有兩種形式存在，一種是大小為190KD的二聚體形式，另一種是大小為95KD的單聚體形式，說(shuō)明CAT-1/GFP可以發(fā)生同源二聚;而利用BS3蛋白交聯(lián)劑處理單個(gè)懸浮CHO-S細(xì)胞，CAT-1/GFP蛋白條帶是單一條帶(9

13、5KD)，表明CAT-1/GFP的同源二聚體形式是反式結(jié)合。說(shuō)明CAT-1具有細(xì)胞粘附分子的生化特征。
　　5、CAT-1蛋白具有促進(jìn)懸浮CHO-S細(xì)胞同源粘附的功能
　　用CAT-1/GFP及GFP對(duì)照慢病毒分別感染CHO-S細(xì)胞，blastidin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，細(xì)胞凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示CAT-1/GFP表達(dá)細(xì)胞株比GFP表達(dá)細(xì)胞株更容易發(fā)生凝集現(xiàn)象（P＜0.05）。除此之外，CAT家族其他幾個(gè)成員，比如CAT

14、-2b、CAT-3和CAT-4也具有促進(jìn)細(xì)胞凝集反應(yīng)的特點(diǎn)，而CAT-4不具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能，說(shuō)明CATs家族促進(jìn)細(xì)胞同源粘附與其氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力無(wú)關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)CAT-1是一種細(xì)胞粘附分子。
　　第二部分:
　　1.降低內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1表達(dá)水平增加內(nèi)皮通透性
　　利用小干擾RNA降低內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1表達(dá)后，EB-albumin通透率升高26±6％，與對(duì)照組細(xì)胞比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而過(guò)表達(dá)CAT-1/

15、GFP后，EB-albumin通透率降低趨勢(shì)，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能機(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞基底水平的CAT-1或其它粘附分子足以維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性;
　　2.L-Arg處理會(huì)降低CAT-1內(nèi)置、抑制內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1介導(dǎo)的細(xì)胞連接分離
　　給予內(nèi)皮細(xì)胞1mM劑量的L-Arg處理后，與對(duì)照組細(xì)胞比較，CAT-1/GFP組細(xì)胞CAT-1內(nèi)置降低，細(xì)胞-細(xì)胞連接分離明顯減慢，L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯增加(P＜0.01)，并且同時(shí)有CAT-

16、1的膜轉(zhuǎn)位現(xiàn)象發(fā)生。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明L-Arg具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接的功能，同時(shí)也為解釋氨基酸悖論（L-Arg paradox）和反式刺激（trans-stimulation）現(xiàn)象提供了新的依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　1.融合蛋白CAT-1/GFP具有與野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能，因此可利用抗GFP抗體和綠色細(xì)胞熒光研究CAT-1蛋白的亞細(xì)胞定位和功能;
　　2.CAT-1是一種新的細(xì)胞粘附分子，通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞