蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、喉癌(laryngeal carcinoma)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率均呈逐年上升的趨勢(shì),嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康與生命。雖然手術(shù)為主,放療與化療為輔的綜合治療方法,使患者的5年生存率有所提高。但對(duì)于那些晚期或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍舊很差,手術(shù)喪失時(shí)機(jī),而傳統(tǒng)放化療又由于其嚴(yán)重的毒、副作用常使得患者不能耐受,從而使患者的治療受到極大的限制。因此,積極尋求喉癌治療的新策略成為廣大耳鼻咽喉科研究者面臨的新課題。
　　 泛

2、素-蛋白酶體通路(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)是真核細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑,是調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程如細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)、增殖、凋亡、信號(hào)傳遞、基因轉(zhuǎn)錄等的關(guān)鍵機(jī)制。它與人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。阻斷UPP可以促使與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的多種蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。于是蛋白酶體抑制劑作為一種新型抗腫瘤靶向治療藥物受到人們的廣泛關(guān)注。硼替佐米作為第一進(jìn)入臨床

3、的蛋白酶體抑制劑已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)用于難治性及復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤及套細(xì)胞淋巴瘤。關(guān)于肺癌及淋巴瘤的研究也已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但蛋白酶體抑制劑在喉癌中的研究甚少,其作用機(jī)制尚不完全清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因3(STAT3,signal transducer and.activator of transcription-3)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要因子,是EGFR、IL-6/JAK.、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道

4、的匯聚的焦點(diǎn),與人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進(jìn)關(guān)系密切。有報(bào)道指出蛋白酶體抑制劑可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中STAT3的激活。在喉癌中,蛋白酶體抑制劑對(duì)STAT3的影響尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。我們前期的研究表明STAT3的激活與喉癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),抑制STAT3的激活可抑制喉癌細(xì)胞的惡性增殖及誘導(dǎo)凋亡。于是本研究以體外培養(yǎng)的人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株為研究對(duì)象,應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、流式細(xì)胞儀、Western Blot、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)探討了

5、蛋白酶體抑制劑對(duì)喉癌細(xì)胞的作用、可能機(jī)制及對(duì)STAT3的影響,并進(jìn)一步聯(lián)合pshSTAT3及常規(guī)化療藥物順鉑誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡作用的觀察,為尋找更加有效的分子靶向、多靶點(diǎn)聯(lián)合治療途徑以及喉癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分為以下三部分:
　　 第一部分蛋白酶體抑制劑MG-132誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡及對(duì)STAT3的影響
　　 目的:通過(guò)檢測(cè)不同濃度及不同作用時(shí)間的蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)體外培養(yǎng)的人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株的增

6、殖、周期分布、凋亡的作用及相關(guān)蛋白表達(dá)的情況,探討蛋白酶體抑制劑對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的作用、相關(guān)機(jī)制及對(duì)STAT3的影響。
　　 方法:
　　 1.以Hep-2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度(0、1、2.5、5、10、20μmol/L)MG-132作用24h、48h及2.5μmol/L MG-132作用0h、12h、24h、48h、72h后細(xì)胞的增殖情況。
　　 2.流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)不同

7、濃度(0、1、2.5μmol/L)MG-132作用48h的細(xì)胞凋亡及2.5μmol/L MG-132作用0h、12h、24h、48h、72h后細(xì)胞凋亡及周期分布情況。
　　 3.Western blot檢測(cè)MG-132(2.5μmol/L)作用0h、12h、24h、48h后,Hep-2細(xì)胞的p21、cyclinD1、CDK4、Bcl-2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.蛋白酶體抑

8、制劑可以有效抑制人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞在體外的增殖并且誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,隨作用濃度及時(shí)間的不同而變化,呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性。
　　 2.蛋白酶體抑制劑可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生G0/G1和G2/M期的雙重阻滯。
　　 3.蛋白酶體抑制劑對(duì)喉癌細(xì)胞作用的機(jī)制之一與p21蛋白水平的上調(diào)及cyclinD1蛋白水平的下調(diào)相關(guān)。
　　 4.蛋白酶體抑制劑在發(fā)揮有效作用的同時(shí)導(dǎo)致了關(guān)鍵信號(hào)分子STAT3蛋白的激活及抗凋亡家族成員

9、Bcl-2蛋白水平的上調(diào),從而在一定的程度上降低了藥物的效能。
　　 第二部分蛋白酶體抑制劑聯(lián)合pshSTAT3對(duì)喉癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　 目的:研究短發(fā)夾RNA沉默STAT3能否增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)喉癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建及擴(kuò)增pshSTAT3,并經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。
　　 2.研究分五組:(1)細(xì)胞對(duì)照組:未經(jīng)任何處理的Hep-2細(xì)胞;(2)陰性對(duì)照

10、質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的Hep-2細(xì)胞;(3)MG-132組:經(jīng)2.5μmol/LMG-132處理的Hep-2細(xì)胞;(4)聯(lián)合組:陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+MG-132(2.5μmol/L)處理的Hep-2細(xì)胞;(5)pshSTAT3組:轉(zhuǎn)染陽(yáng)性重組質(zhì)粒的Hep-2細(xì)胞。
　　 3.利用MTT和FCM兩種方法分別檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞的增殖活性及凋亡率的情況。
　　 4.Western blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)

11、胞p-STAT3蛋白表達(dá)的情況。
　　 結(jié)論:pshSTAT3可以抑制MG-132誘導(dǎo)的STAT3蛋白的激活,從而提高了蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。
　　 第三部分蛋白酶體抑制劑MG-132聯(lián)合化療誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡的觀察
　　 目的:探討蛋白酶體抑制劑MG-132能否增強(qiáng)常規(guī)化療藥物順鉑(DDP)對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的毒性作用。
　　 方法:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-2細(xì)胞分為四組:對(duì)照組、M