蛋白酶體抑制劑MG-132抗人肝癌BEL-7402細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：肝癌是一種常見的惡性腫瘤，大多數(shù)病人預(yù)后差，診斷后中數(shù)生存期短于6個月。目前，化療仍是臨床上肝癌治療的主要手段。但傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用大和腫瘤對化療的耐藥性是治療失敗的主要原因。尋找有效安全的抗腫瘤新藥成為肝癌研究的熱點(diǎn)。泛素．蛋白酶體通路是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的一個主要途徑。泛素化和蛋白酶體水解的底物包括許多負(fù)責(zé)細(xì)胞細(xì)胞周期和腫瘤生長的蛋白，如p53、p21、Bax、核因子抑制蛋白I-κB等。抑制這些蛋白降解，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖抑制

2、、凋亡發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG-132可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，而對正常細(xì)胞無明顯抑制作用。 目的：本研究選用人肝癌BEL-7402細(xì)胞體外培養(yǎng)，探討蛋白酶體抑制劑MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制，從細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡信號傳導(dǎo)通路等方面揭示MG-132抗癌機(jī)理；聯(lián)合應(yīng)用MG-132與抗肝癌藥物表阿霉素作用于BEL-7402細(xì)胞，確定MG-132是否對表阿霉

3、素的抗肝癌作用具有化療增敏效應(yīng)，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞系BEL-7402，MG-132濃度設(shè)定為2.5、5.0、10.0μmol/L，未加MG-132組為對照組，采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)觀察2.5～10.0μmol/L MG-132人肝癌細(xì)胞系BEL一7402增殖動力學(xué)的影響：MTT法測細(xì)胞的生長抑制率；(2)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期；(3)透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；(4

4、)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段分析觀察細(xì)胞凋亡；(5)比色法測半胱天冬酶caspase-3活性的變化；(6)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞p53、p21、Bax蛋白變化。第一部分：MG-132對BEL-7402細(xì)胞增殖和凋亡的影響 (1)MTT法檢測顯示，2.5～10.0μmol/L的MG-132對BEL-7402細(xì)胞均有抑制作用，抑制作用隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長而增強(qiáng)。 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示MG-132能明顯誘導(dǎo)B

5、EL-7402細(xì)胞凋亡(5.01amol/L組、10.0gmol/L組與對照組相比，P均<0.01)；凋亡率均隨藥物濃度增加而升高，24h、48h二時(shí)間點(diǎn)，5.0μmol/L組與10.0μmol/L組相比，凋亡率有顯著差異，P<0.01；相同濃度作用的二時(shí)間點(diǎn)，凋亡率相比有顯著差異，P<0.01。 (3)透射電鏡下，經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用48小時(shí)后，部分BEL-7402細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞體積

6、縮小，細(xì)胞膜呈皺折狀凹陷。微絨毛減少甚至消失，胞漿濃縮，細(xì)胞器減少，染色質(zhì)固縮，邊緣化，有些細(xì)胞以出芽方式形成凋亡小體。 (4)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段分析顯示經(jīng)5.0μmol/L，MG-132作用48小時(shí)后，出現(xiàn)明顯“階梯狀”條帶，而未用MG-132處理的對照組則無。 (5)BEL-7402細(xì)胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用12、24小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)顯示G<,2>/M期細(xì)胞比例增加，呈現(xiàn)一定時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系

7、。第二部分：MG-132對BEL-7402細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的分子機(jī)制 (1)BEL-7402細(xì)胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用12、24小時(shí)后，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示p53、p21蛋白水平增高，分別與對照組相比，P均<0.001，且有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 (2)BEL-7402細(xì)胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用24、48小時(shí)后，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Bax蛋白水平增高，與對照組相比，P均<0.001，

8、且有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 (3)比色法測BEL-7402細(xì)胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用48小時(shí)后，caspase-3活性顯著升高，與對照組相比，P<0.05。第三部分：MG-132對表阿霉素抗肝癌BEL-7402細(xì)胞作用的化療增敏效應(yīng)及機(jī)制 (1)2.51μmol/L MG-132與100μg/L表阿霉素共同干預(yù)BEL-7402細(xì)胞，較之單用相應(yīng)劑量MG-132或表阿霉素抑制細(xì)胞的活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)。

9、 (2)單用2.5μmol/L MG-132及與100μg/L表阿霉素聯(lián)合作用BEL-7402細(xì)胞后相比對照組，Bax蛋白水平升高。 結(jié)論： (1)MG-132可以時(shí)間和劑量依賴方式抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖，將其阻滯于G<,2>/M期，誘導(dǎo)其凋亡。 (2)MG-132可能通過提高細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p53、p21和促凋亡蛋白Bax表達(dá)、阻斷細(xì)胞周期G<,2>期檢查點(diǎn)、激活caspase-3等途徑抑制B