蛋白酶體抑制劑(PS-341)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：PS-341(又名Bortezomib或Velcade)是一類可逆的選擇性蛋白酶體抑制劑，是首個(gè)由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床多發(fā)性骨髓瘤治療的藥物。本課題主要探討PS-341對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療作用，包括PS-341誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，以及與全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合用于誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化治療，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究PS-341誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)制。
　　 方法：1)選用神經(jīng)母細(xì)胞

2、瘤細(xì)胞株CHP126為研究對(duì)象，用PS-341處理72h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況并通過IC50計(jì)算軟件計(jì)算藥物作用于該細(xì)胞的IC50值；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)來檢測(cè)隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)CHP126細(xì)胞的增殖情況，并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；細(xì)胞經(jīng)碘化丙錠(P1)單染或是P1和Annexin V復(fù)染，用流式細(xì)胞分析術(shù)分析PS-341對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響；采用DAPI染色來檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)的變化；通過Western blot栓測(cè)PS-341對(duì)

3、NFкB通路相關(guān)蛋白、p21蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3、PARP、Bcl-2及Bax表達(dá)水平的影響；應(yīng)用Real-time quantitative PCR assay檢測(cè)p21 mRNA的表達(dá)水平。2)選用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株CHP126及SH-SY5Y為研究對(duì)象，采用臺(tái)盼蘭染色法來檢測(cè)上述細(xì)胞對(duì)于PS-341及ATRA的敏感性，并選取引起細(xì)胞凋亡率不高于空白對(duì)照組5％的濃度為給藥濃度，將給藥方式設(shè)為PS-341

4、與ATRA單用組及兩藥合用組，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法來檢測(cè)各個(gè)給藥方式下神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖情況，并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；同時(shí)鏡下觀察并記錄給藥后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，運(yùn)用ImagePro5.0軟件分析并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞突觸的生長(zhǎng)情況及細(xì)胞的分化百分率；采用細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化標(biāo)記物Tau及β-III Tubulin蛋白表達(dá)情況的影響，并檢測(cè)維甲酸相關(guān)受體RARα、RARβ及分化相關(guān)蛋白p27和JNK等蛋白的表達(dá)情

5、況；采用原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)5 nMPS-341、20 nM PS-341、10 nM ATRA、5μM ATRA，5 nM PS-341與10 nMATRA合用處理原代神經(jīng)元細(xì)胞72 h，經(jīng)P1染色后用流式細(xì)胞分化術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況，并進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，caspase9及caspase3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1)PS-341作用CHP126細(xì)胞72 h的IC50值為11.25

6、 nM；用0、5、10及20 nM PS-341處理CHP126細(xì)胞24、48及72 h，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明PS-341可顯著抑制CHP126細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示PS-341并不影響CHP126的細(xì)胞周期分布，但是能顯著誘導(dǎo)CHP126細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中5、10及20 nM PS-341作用72 h，CHP126細(xì)胞的凋亡率分別為14.6％、39.6％及58.2％，20 nM PS-341分別作用6、12、24、48和72

7、h后，CHP126細(xì)胞的凋亡率分別為15.3％、17.9％、18.3％及55-1％； DAPI染色結(jié)果顯示，PS-341藥物作用濃度的升高及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致CHP126細(xì)胞核固縮的加劇及凋亡小體的增多；Western blot結(jié)果顯示，PS-341作用于CHP126細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)NFкB(p65)及胞漿中p-IкB及IкB蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有變化，而p21蛋白和mRNA的表達(dá)水平都有較大的提高。同時(shí)，PS-341可顯著抑制CHP

8、126細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)，伴隨著caspase3的裂解生成Cleaved caspase3，進(jìn)而促使PARP發(fā)生水解，產(chǎn)生85 kd的裂解片段，最終引起細(xì)胞的凋亡。2)以不同濃度的PS-341與ATRA聯(lián)合應(yīng)用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤CHP126及SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，采用臺(tái)盼蘭染色確定細(xì)胞凋亡率，選取以引起的細(xì)胞凋亡率不高于陰性對(duì)照組5％的藥物濃度為本實(shí)驗(yàn)的給藥濃度，PS-341為5 nM，ATRA為10nM。細(xì)胞

9、增殖實(shí)驗(yàn)表明PS-341與ATRA合用可顯著抑制CHP126及SH-SY5Y細(xì)胞的增殖；且藥物合用組引起的細(xì)胞突觸的長(zhǎng)度及細(xì)胞的分化百分率明顯高于單用組，其中ATRA單用組中細(xì)胞分化百分率為28.0％，ATRA與PS-341合用組可高達(dá)50.0％：細(xì)胞免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，PS-341單用并不會(huì)改變CHP126及SH-SY5Y細(xì)胞中Tau和β-III Tubulin的表達(dá)，ATRA單用可上調(diào)Tau和β-III Tu

10、bulin蛋白的表達(dá)水平，PS-341可協(xié)同ATRA顯著上調(diào)Tau和β-IIITubulin蛋白的表達(dá)水平。另外，ATRA可引起CHP126細(xì)胞中維甲酸受體RARα蛋白表達(dá)的下降，而PS-341與ATRA合用可增進(jìn)RARα蛋白的累積，同時(shí)伴隨RARβ、JNK及p27蛋白表達(dá)的增加。此外，以不同濃度的PS-341與ATRA聯(lián)合應(yīng)用于新生鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，結(jié)果顯示5 nM PS-341、10 nMATRA單用或者合用均不會(huì)引起海馬神經(jīng)元細(xì)

11、胞的凋亡，而5μM ATRA作用72 h即可誘導(dǎo)24.02％的海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，20 nM PS-341引起的細(xì)胞凋亡率為58.77％；此外，20 nM PS-341作用72 h可顯著上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，5μM ATRA及20 nM PS-341都會(huì)下調(diào)Bcl-2、caspase9及caspase3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：通過對(duì)PS-341體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤CHP126細(xì)胞凋亡及其聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY

12、5Y及CHP126細(xì)胞分化的系統(tǒng)研究，我們得出以下結(jié)論：1)PS-341可誘導(dǎo)CHP126細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制主要是通過上調(diào)p21和Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)水平，提高了Bax/Bcl-2的比率，從而激活caspase3發(fā)生裂解，導(dǎo)致PARP裂解產(chǎn)生85 kd的裂解片段，阻礙了細(xì)胞DNA的自我修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡；2)PS-341可協(xié)同ATRA抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤CHP126和SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，并且伴隨著細(xì)胞分化水平的