侵襲性煙曲霉感染早期病原學(xué)診斷方法研究.pdf

1、隨著大劑量免疫抑制劑、化療藥物以及廣譜抗生素的應(yīng)用，侵襲性真菌感染(IFI)的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)迅速上升。由于缺乏臨床特征，血液真菌分離培養(yǎng)敏感性很低，IFI的病原學(xué)診斷十分困難，特別是侵襲性煙曲霉感染。因此，迫切需要研究發(fā)展敏感性強、特異性高的非培養(yǎng)診斷方法來改善侵襲性真菌感染的病原學(xué)診斷。 目的: 通過煙曲霉深部感染動物模型的建立，考察巢式PCR方法及血清半乳甘露聚糖(GM)測定方法在侵襲性煙曲霉感染早期診斷

2、中的價值；并對煙曲霉深部感染過程中所釋放的優(yōu)勢抗原成分進行初步探討。 方法: 選擇幾種常見真菌，分別用六種方法(液氮凍融、-70℃凍融、溶胞酶消解、超聲破碎、高鹽溶液、尿素溶液)裂解真菌細胞壁，再用市售DNeasyBlood&TissueKit試劑盒提取DNA，通過對提取物進行比色定量和PCR檢測評價各種提取方法的優(yōu)弊；建立煙曲霉深部感染動物模型，收集不同感染時期動物血液標本進行巢式PCR的檢測，并與血培養(yǎng)及影像學(xué)檢查結(jié)

3、果比較分析；評價巢式PCR在臨床煙曲霉感染高危病人標本檢測中的應(yīng)用價值，并與血清半乳甘露聚糖水平測定比較分析；提取煙曲霉全菌蛋白和分泌蛋白，用侵襲性煙曲霉感染動物不同感染階段的血清進行免疫印跡，篩選煙曲霉早期免疫反應(yīng)性抗原。 結(jié)果: (1)酶消解破壁法提取真菌DNA效率最高，重復(fù)性良好。模擬全血標本中白假絲酵母菌檢測限為102個孢子，煙曲霉及新型隱球菌檢測限為103個孢子。 (2)巢式PCR在煙曲霉深部感染家兔發(fā)

4、病早期(第2天)出現(xiàn)陽性結(jié)果，并可持續(xù)數(shù)日，優(yōu)于培養(yǎng)及影像學(xué)檢查方法；巢式PCR和GM檢測在臨床診斷為IA患者的標本評價中顯示，其敏感性分別為69％和62％，特異度分別為100％和95％。 (3)煙曲霉分泌型蛋白成分可刺激疾病模型動物產(chǎn)生抗體，在病原學(xué)診斷中具有較高的應(yīng)用價值。其中免疫反應(yīng)性較強的蛋白分子量大小為10kDa-30kDa。 結(jié)論: 在六種真菌基因組DNA提取方法中，酶裂解結(jié)合試劑盒提取方法最為簡便有