侵襲性肺曲霉病早期診斷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　復(fù)制免疫抑制(immunocompromised host，ICH)模型和構(gòu)建侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)模型，評(píng)價(jià)和比較血清半乳甘露聚糖(Galactomannan GM)濃度測(cè)定和PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)在侵襲性肺曲霉病早期診斷中的臨床價(jià)值，為臨床早期診斷IPA提供理論基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　首先對(duì)模型組注射環(huán)磷酰胺(cyclophos

2、phami de CY)復(fù)制ICH動(dòng)物模型。通過霧化108cfuml-1、109cfu·ml-1兩種濃度的孢子懸液12ml，空白組以滅菌PBS代替孢子懸液。分別于感染后第1、3、5天眼球取血處死小鼠，并收集標(biāo)本。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)血清中半乳甘露聚糖的濃度;以PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)各組小鼠血清、肺泡灌洗液、肺組織中的曲霉菌DNA;肺組織病理標(biāo)本行蘇

3、木素-伊紅(Hematoxylin-Eosine，HE)染色、糖原染色(periodic acid shiffPAS)染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，分析比較GM實(shí)驗(yàn)和反向斑點(diǎn)雜交法在侵襲性肺曲霉病早期診斷中的作用。
　　[結(jié)果]
　　1.小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化對(duì)注射CY后的小鼠，取尾靜脈血后，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)液（2％乙酸溶液）進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，與正常組對(duì)比，注射第2天的淋巴細(xì)胞數(shù)量降低顯著(P＜0.05)。
　　

4、2.ICH、IPA小鼠的反應(yīng)性觀察對(duì)小鼠腹腔注射200mgkg-1Cy，連續(xù)注射2天，體毛蓬松凌亂，缺少光澤。小鼠較萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)明顯減少。ICH小鼠經(jīng)高濃度Afs感染后表現(xiàn)為皮毛粗糙，萎靡少動(dòng)，食欲差，呼吸急促，口周圍出血嚴(yán)重、煩躁不安和腹肌抽搐甚至死亡等癥狀，不同劑量組小鼠死亡率差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　3.肺組織病理改變第3天時(shí)，B組小鼠肺組織可見肺膿腫，可見到孢子;第5天時(shí)肺內(nèi)有孢子聚積，可見到菌絲，以及

5、較嚴(yán)重的出血和充血，肺泡間隔增寬，氣管上皮細(xì)胞脫落壞死。C組小鼠肺組織可見充血，肺泡彈性纖維被破壞，炎癥和出血，未見有孢子菌絲，組織病理檢測(cè)標(biāo)本的陽性率為100％。
　　4.GM-ELISA法測(cè)定血清、肺泡灌洗液中半乳甘露聚糖濃度
　　實(shí)驗(yàn)組血清和BALF標(biāo)本各56份，在感染曲霉菌第1天陽性率者為21例(53％)，第3天陽性者28份(69％)，第5天陽性者為30份(88％)，實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d血清、BALF的GM均

6、值呈升高趨勢(shì)，其中實(shí)驗(yàn)組相同感染天數(shù)時(shí)BALF的陽性率高于血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。實(shí)驗(yàn)組血清、BALF的GM實(shí)驗(yàn)敏感性、特異性與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　5.反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)血清、肺泡灌洗液、肺組織中曲霉菌DNA含量
　　實(shí)驗(yàn)組陽性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。隨著感染時(shí)間的延長，標(biāo)本陽性率逐漸上升，肺組織的陽性率高于BALF高于血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

7、.005)，用標(biāo)本的反向斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)與GM實(shí)驗(yàn)、組織病理陽性率進(jìn)行比較，組織病理的陽性率最高，其次是反向斑點(diǎn)雜交，三種方法的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　[結(jié)論]
　　1.成功復(fù)制小鼠免疫抑制模型，霧化Afs高濃度(109cfu.ml-1)能建立具有典型病理特征的穩(wěn)定的IPA模型;
　　2.用煙曲霉特異性引物擴(kuò)增標(biāo)本中提取的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳可顯示出一條260kb的特異性條帶。
　　3.GM-ELI