斑點(diǎn)雜交法在侵襲性煙曲霉菌感染診斷中的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、研究背景與目的 近幾年來隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種疾病的治療手段不斷創(chuàng)新，如造血干細(xì)胞移植術(shù)、器官移植術(shù)、腫瘤化療術(shù)及導(dǎo)管置管術(shù)的廣泛開展，廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及艾滋病人群的不斷增加，致使條件致病真菌感染率不斷上升。2003年北京協(xié)和醫(yī)院統(tǒng)計(jì)的侵襲性真菌感染（Invasive fungal infection，IFI）發(fā)生率是20世紀(jì)九十年代的3．6倍，哈爾濱血液病腫瘤研究所2004年報(bào)道的血液病IFI發(fā)生

2、率是上世紀(jì)末的4．0倍。目前臨床上常見的深部真菌是念珠菌、曲霉菌、新隱球菌等。念珠菌約占40％～70％，而近年來曲霉菌感染率比往年有明顯增高，在中性粒細(xì)胞缺乏和骨髓移植的患者中，侵襲性曲霉?。↖nvasive Aspergillus，IA）的感染率高達(dá)50％，是危害最大且預(yù)后最差的深部真菌感染，而且死亡率極高。其中煙曲霉是引起侵襲性曲霉菌感染中最常見而且致病性最強(qiáng)的菌種。 探索早期、特異、敏感的快速診斷方法一直是曲霉菌感染研究領(lǐng)

3、域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的診斷方法時(shí)間長，敏感性低，適用性差。目前人們把焦點(diǎn)集中到曲霉菌血清學(xué)和分子生物學(xué)的快速檢測兩個(gè)方面上。已有的血清學(xué)方法中，抗體檢測法因患者存在免疫抑制，使抗體水平低不能反映患者的感染情況而受到限制。血液中抗原檢測方法雖然有優(yōu)勢，但由于抗原量少以及方法學(xué)的不足未得到廣泛開展。最近出現(xiàn)的半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）抗原檢測的ELISA方法，具有很好的靈敏性，已在歐美國家廣泛開展，但其價(jià)格昂貴，在國內(nèi)

4、廣泛應(yīng)用有一定困難。另外，在中性粒細(xì)胞缺乏的血液病患者中，存在抗原遞呈功能和淋巴細(xì)胞功能損害，使得血清學(xué)試驗(yàn)（如半乳甘露聚糖試驗(yàn)等），喪失了診斷價(jià)值。 研究方法: 1．煙曲霉菌種特異性探針的制備： 真菌DNA的提?。篋NA的提取采用CTAB法。 煙曲霉種特異性探針（ALP）基因片段引物：上游引物5'-TCCGTGTACTTGATGGGTCT-3’下游引物5’-ATGTACGAGGATGTGAGCCG-3’

5、引物參照文獻(xiàn)報(bào)道的核苷酸序列。 PCR擴(kuò)增ALP基因、產(chǎn)物分析與測序：ALP基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為465bp。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相后切膠回收純化，并進(jìn)行測序，結(jié)果與GenBank提供的ALP基因文庫序列號進(jìn)行對比以確定其基因來源。 2．探針的標(biāo)記與斑點(diǎn)雜交： ALP基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后用隨機(jī)引物法進(jìn)行地高辛標(biāo)記，將煙曲霉、黃曲霉、念珠菌、隱球菌等真菌以及細(xì)菌DNA固定于帶正

6、電荷的尼龍膜上再與地高辛標(biāo)記的探針行斑點(diǎn)雜交，雜交結(jié)果陽性，可確定有煙曲霉菌感染。 3．侵襲性煙曲霉菌動物感染模型的建立： 實(shí)驗(yàn)分組：72只SD大鼠分為三組，實(shí)驗(yàn)組48只，正常對照組及免疫抑制組各12只。 免疫抑制及感染模型的建立：將實(shí)驗(yàn)組和免疫抑制對照組，分別給每只大鼠肌肉注射地塞米松0．6mg/kg，環(huán)磷酰胺75mg/kg，連續(xù)兩天。在免疫抑制后第3天，實(shí)驗(yàn)組給予肌肉注射地塞米松0．6mg/kg后，將1×10

7、8/ml煙曲霉孢子混懸液緩慢滴入大鼠雙鼻孔內(nèi)，并使大鼠保持直立。每次滴入0．3～0．4 ml，1次/天，連續(xù)3天。免疫抑制對照組給予肌肉注射地塞米松0．6mg/kg，經(jīng)雙鼻孔滴入生理鹽水0．3～0．4 ml，1次/天，連續(xù)3天。 血清、肺泡灌洗液及內(nèi)臟標(biāo)本的采集及處理：實(shí)驗(yàn)組接種完成后1、3、5、7天分批心臟采血處死大鼠，正常對照組和免疫抑制對照組于第7天處死，收集大鼠的血清和肺泡灌洗液標(biāo)本，-20℃下保存?zhèn)溆谩o菌操作下，手術(shù)

8、切取動物的肺、肝、脾等臟器，切取部分臟器組織制成勻漿，接種于沙氏平板上培養(yǎng)。其余內(nèi)臟組織塊放入10％福爾馬林中固定8小時(shí)以上，石蠟包埋，并進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）以及六胺銀（PASM）染色。 4．動物模型標(biāo)本斑點(diǎn)雜交的檢測： 血清、肺泡灌洗液標(biāo)本中真菌DNA的提取方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行，將提取好的標(biāo)本DNA固定于帶正電荷的尼龍膜上，與標(biāo)記好的煙曲霉長鏈核苷酸探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行對比，斑點(diǎn)雜交法與BALF培養(yǎng)法進(jìn)

9、行比較。 5．臨床標(biāo)本的收集及檢測; 臨床病例資料：臨床曲霉菌感染高?；颊?2例，男8例，女4例，其中病理確診2例，臨床診斷4例，擬診6例。收集上述患者的血清或肺泡灌洗液標(biāo)本，低溫凍存?zhèn)溆谩Ｓ冒唿c(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行檢測。 6．統(tǒng)計(jì)分析方法：使用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件，PearsonX2檢驗(yàn)，多樣本率的比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1．煙曲霉堿性蛋白酶（ALP）特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果： 用合成的煙曲霉特

10、異的引物依次擴(kuò)增煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、白念珠菌、銅綠假單孢菌、人全血細(xì)胞DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，結(jié)果顯示除煙曲霉擴(kuò)增出1條465bp的特異條帶外，其余真菌、細(xì)菌均未見特異性擴(kuò)增帶。結(jié)果表明該對引物對煙曲霉具有高度特異性。產(chǎn)物測序結(jié)果與基因文庫登錄號NC．007197．11為參照序列進(jìn)行對比，相似度達(dá)99％。 2．斑點(diǎn)雜交結(jié)果： 雜交結(jié)果的特異性：提取的煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、乙

11、肝病毒、人全血細(xì)胞DNA配制成10mg/ml，各取3μl分別點(diǎn)樣于尼龍膜上，與地高辛標(biāo)記的煙曲霉特異性探針進(jìn)行雜交。此探針只與煙曲霉DNA雜交，與其它真菌、細(xì)菌DNA無交叉反應(yīng)，結(jié)果表明此探針具有高度的特異性， 雜交結(jié)果的敏感性：將提取的煙曲霉DNA倍比稀釋分別點(diǎn)樣于尼龍膜上，與煙曲霉探針雜交，最低可檢出DNA的量為100fg，結(jié)果表明此探針有高度的敏感性。 3．侵襲性感染模型的建立： 臟器組織培養(yǎng)及血培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)

12、組大鼠尸檢見肝臟腫脹，表面見多個(gè)針尖大小的膿點(diǎn)，肺組織表面可見多個(gè)大小不等隆起的小結(jié)節(jié)，余內(nèi)臟未見膿點(diǎn)及結(jié)節(jié)。臟器組織培養(yǎng)可見煙綠色菌落生長，質(zhì)地呈絨毛狀，背面呈淡黃色，鏡下觀察見有曲霉孢子和菌絲，菌絲呈條狀有分隔分支呈45°銳角證實(shí)為煙曲霉。正常對照組和免疫抑制對照組：臟器培養(yǎng)均未見煙曲霉菌生長。血培養(yǎng)均未見真菌生長。 臟器組織HE染色及PASM染色：實(shí)驗(yàn)組組織病理切片作HE染色，肺和肝組織可見組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，組織壞死，切

13、片作六胺銀（PASM）染色在壞死組織中可見成堆的菌絲，菌絲呈條狀有分隔，分支為銳角。真菌組織學(xué)培養(yǎng)和組織病理切片六胺銀染色證實(shí)為煙曲霉，侵襲性曲霉菌動物模型制作成功。正常對照組和免疫抑制對照組：臟器組織HE染色及PASM染色未見異常 4．動物模型標(biāo)本檢測結(jié)果： 將收集的血及肺泡灌洗標(biāo)本提取DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，實(shí)驗(yàn)組陽性率較正常對照組和免疫對照組高，P<0．05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨感染時(shí)間延長，陽性率逐漸上升，感染后第1

14、天實(shí)驗(yàn)組雜交結(jié)果與免疫抑制和正常對照組差異均無顯著性差異（P>0．00625），感染后第3天血清標(biāo)本與免疫抑制對照組也無顯著性差異（P>0．00625）。其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．00625）?？偟撵`敏度為67．6％，特異度為89．6％。1周內(nèi)肺泡灌洗液斑點(diǎn)雜交法的總陽性率（68．8％）較培養(yǎng)陽性率（31．2％）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05），特異度比較斑點(diǎn)雜交法（91．7％）低于肺泡灌洗液培養(yǎng)法（95．8％），但差異無

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。血培養(yǎng)陽性率很低，但所需時(shí)間長不利于早期診斷。 5．臨床標(biāo)本檢測結(jié)果： 在臨床侵襲性曲霉菌感染高?；颊?2例中，經(jīng)病理確診曲霉菌感染2例，臨床診斷曲霉菌感染4例，擬診曲霉菌感染病例6例。將采集的血清和肺泡灌洗液標(biāo)本提取DNA，用前兩部分建立的斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果有6例陽性。確診曲霉菌感染病2例斑點(diǎn)雜交檢測均為陽性。臨床診斷的4例中有3例為陽性，6例擬診病例有1例為陽性。其余病例標(biāo)本經(jīng)斑

16、點(diǎn)雜交檢測，結(jié)果均為陰性。 研究結(jié)論: 1．成功建立了斑點(diǎn)雜交法檢測曲霉菌感染技術(shù)：設(shè)計(jì)的煙曲霉種特異性探針對煙曲霉有高度的特異性，與其它真菌、細(xì)菌無交叉反應(yīng)，此方法可以將曲霉菌鑒定到種的水平。且靈敏度高，最低可檢測到100fg的真菌DNA． 2．完成了斑點(diǎn)雜交法在侵襲性動物模型中臨床效能的評價(jià)：成功建立經(jīng)鼻孔滴入煙曲霉孢子建立動物感染模型，尸檢臟器損害以肺、肝比較明顯。斑點(diǎn)雜交法可以檢測出模型動物血清及肺泡灌洗