活性氮簇在衰老大鼠心肌組織的含量變化及可能的意義.pdf

1、活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是已知的衰老過程中蛋白修飾和細胞損傷的重要介質(zhì)。但衰老動物心肌細胞凋亡的增加并不能單一用ROS的產(chǎn)生解釋。近年來大量研究資料表明，源于一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的活性氮簇(Reactive Nitrogen Species， RNS)也是蛋白修飾和細胞損傷的重要介質(zhì)。NO由三種一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase

2、，eNOS；Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS；Neuronal Nitric Oxide Synthase， nNOS)催化L-精氨酸生成。 大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的雙重作用，濃度、胞內(nèi)時空分布、氧化還原狀態(tài)可能是RNS促進或抑制細胞凋亡的決定因素。生理狀態(tài)的NO(低濃度的NO)可直接與O<,2>生成NO<,2>，后者再與另-NO反應生成N<,2>O<,3>，N<,2>O<,

3、3>可作為NO<'+>供體，使蛋白質(zhì)發(fā)生S-亞硝基化，后者是NO抗凋亡效應的主要途徑；而高濃度的NO(如iNOS催化生成的NO)可以與O<,2><'->反應生成極為活躍的過氧亞硝基(ONOO<'->)，它可以作為NO<,2><'+>的供體導致蛋白質(zhì)的硝基化，后者是NO致凋亡效應的主要途徑。細胞培養(yǎng)研究證明，衰老的內(nèi)皮細胞中S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量下降，但衰老心臟心肌細胞的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量是否下降，以及衰老的心肌細胞凋亡增高的原因是否

4、與其RNS的促凋亡和抑凋亡效應失調(diào)有關還未確定。 NO不能直接引起蛋白質(zhì)S-亞硝基化，必需通過NO<'+>供體(N<,2>O<,3>)或NO丟失一個電子產(chǎn)生NO<'+>來參與這一過程。由于N<,2>O<,3>的生成需要2分子的NO，在細胞膜中脂溶性的NO與O<,2>更易聚集而生成NO<'+>供體---N<,2>O<'3>，從而使蛋白質(zhì)更易發(fā)生 S-亞硝基化。由于eNOS是唯一與膜相關的NOS，其含量和活性很可能與蛋白質(zhì)S-亞硝基

5、化密切相關。有研究資料表明，衰老動物及培養(yǎng)的衰老細胞中eNOS的含量和活性下降，但老年大鼠心肌組織中的eNOS表達變化報道不一；此外，eNOS表達水平是否與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量相關還不清楚。 方法： (1)分別選取雄性成年(4-6月，n=10)和老年(22-24月，n=16)SD大鼠，設立成年大鼠組與衰老大鼠組，經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管進入左心室，監(jiān)測心率、左心室壓力、左心室壓力變化最大速率和心肌收縮指數(shù)(Cardiac I

6、ndex，CI)等心功能指標； (2)分別采用原位末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling，TUNEL)和caspase-3活性測定法檢測心肌組織中細胞凋亡發(fā)生情況： (3)采用免疫組化方法檢測心肌組織中的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的分布及含量； (4)利用NitroGlo試劑盒

7、(PerkinElmer)檢測心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達水平； (5)用Western-blot法檢測心肌組織中eNOS和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達； (6)硝基酪氨酸(Nitrotyrosine，NT)是體內(nèi)生成過氧亞硝基(ONOO<'->)的標志物，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測NT的表達。 結(jié)論：

8、1.衰老大鼠心肌細胞凋亡增加、心臟相對質(zhì)量下降、心功能明顯降低； 2.衰老大鼠心肌組織中，具有細胞毒性的ONOO<'->大量生成，而保護心肌細胞的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量下降，減弱其對心肌細胞凋亡的抑制作用。因此，衰老大鼠心肌組織中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡，有可能通過促進心肌細胞凋亡導致心肌細胞丟失，最終造成心臟收縮和舒張功能的下降。 3.與成年大鼠相比，衰老大鼠心肌組織中iNOS表達明顯增高：同時，eNOS表達明顯下