成年大鼠心肌缺血-再灌注后心肌組織中XIAP的動態(tài)表達(dá)及可能的意義.pdf

1、研究背景：世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2030年缺血性心臟病將成為威脅人類健康的第二大疾病，其中冠狀動脈梗塞引起的心肌缺血是缺血性心臟病中最重要的致死原因。心肌缺血可以啟動一系列的病理生理過程，導(dǎo)致心臟功能障礙。冠脈梗塞后盡早對缺血區(qū)進(jìn)行有效的血液再灌注，是減少心肌細(xì)胞死亡、改善心臟功能唯一有效的方法。然而臨床及基礎(chǔ)實驗均發(fā)現(xiàn)，再灌注本身也會加重并擴(kuò)大缺血后心肌的損傷，即發(fā)生再灌注損傷。因此，揭示再灌注損傷可能的機(jī)制已成為治療缺血性心臟病的研究

2、靶點(diǎn)。
　　 目的：⑴觀察大鼠心肌缺血/再灌注不同時間點(diǎn)心肌組織中XIAP動態(tài)表達(dá)特征。⑵觀察心肌組織中XIAP表達(dá)下降是否與大鼠心肌缺血/再灌注損傷有關(guān)。
　　 方法：①分別選取成年雄性SD大鼠(4-6月，n=103，死亡11只，實際用于實驗研究92只)隨機(jī)分為3組，即心肌缺血/再灌注組(結(jié)扎左冠狀動脈前降支)、偽手術(shù)組(不結(jié)扎左冠狀動脈前降支)及心肌缺血/再灌注后給藥組。②各組實驗動物分別經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管進(jìn)入左心室

3、，監(jiān)測左室收縮壓(Left VcntricularSystolic Pressure，LVSP)，左室舒張壓(Left Ventricular Diastolic Pressure，LVDP)，左心室壓力上升/下降最大變化速率(+dp/dtmax及-dp/dtmax)等心功能指標(biāo)。③分別采用Caspase-3活性測定和DNA原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測各組心肌組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況；④用WesternBlot技術(shù)檢測各組大鼠心

4、肌組織中XIAP的蛋白表達(dá)水平；⑤用Real Time PCR技術(shù)檢測大鼠心肌組織中XIAP的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：⑴Caspase-3活性測定結(jié)果Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，其活性可以定量反應(yīng)細(xì)胞凋亡水平，Caspase3活性越大，細(xì)胞凋亡水平越高。結(jié)果顯示，與偽手術(shù)組(1.00±0.21)相比，心肌缺血/再灌注大鼠心肌組織中Caspase-3比活性從再灌注1小時開始升高(1.55±0.24，P＜0.0

5、5)，再灌注12小時達(dá)到高峰(1.66±0.21，P＜0.05)，此后逐漸下降，并于再灌注24小時活性趨于正常(1.21±0.13，P＞0.05)。⑵TUNEL染色是檢測細(xì)胞凋亡的一種較靈敏的方法。用TUNEL方法檢測缺血/再灌注12小時的心肌細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注組大鼠心肌組織中陽性染色的凋亡細(xì)胞核明顯多于偽手術(shù)組；經(jīng)計算得：心肌缺血/再灌注組心肌細(xì)胞的凋亡率為14.75±1.54％，明顯高于同期偽手術(shù)組(136±0

6、.47％，P＜0.05)。⑶+dp/dtnax，LVSP分別代表左心室壓力上升最大變化速率和左心室收縮壓，它們可以反映心臟收縮功能。指標(biāo)數(shù)值越大，心功能越好。結(jié)果顯示，+dp/dtmax從再灌注12小時(404.76±137.94Kpa/s vs.同期偽手術(shù)組633.00±59.48Kpa/s，P＜0.05)開始下降，該變化一直持續(xù)至再灌注24小時(388.71±93.51Kpa/s vs.同期偽手術(shù)組653.42±61.41Kpa/s

7、，P＜0.05)。而LVSP各組間比較并無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑷-dp/dtmax數(shù)值越大，心功能越好；LVDP指標(biāo)數(shù)值越小，心臟舒張功能越好。結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注組大鼠-dp/dtmax從再灌注12小時(335.00±109.00Kpa/s vs.同期偽手術(shù)組427.83±72.92Kpa/s，P＜0.05)開始下降，該變化一直持續(xù)至再灌注24小時(353.71±97.21Kpa/s vs.同期偽手術(shù)組459.42±66

8、.22Kpa/s，P＜0.05)；而LVDP從再灌注12小時(1.10±0.99Kpa vs.同期偽手術(shù)組-1.00±0.77Kpa,P＜0.05)開始升高，該變化一直持續(xù)至再灌注24小時(0.79±0.50Kpa vs.同期偽手術(shù)組-1.18±0.64Kpa，P＜0.05)。以上實驗結(jié)果顯示：心肌缺血/再灌注后大鼠心臟的收縮和舒張功能都出現(xiàn)了不同程度的下降，并且在再灌注12和24小時出現(xiàn)明顯的心功能障礙。⑸成年大鼠心肌缺血/再灌注不同

9、時間點(diǎn)心肌組織XIAP蛋白水平的檢測用Western Blot檢測成年大鼠心肌缺血/再灌注不同時間點(diǎn)心肌組織中XIAP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明：心肌缺血/再灌注大鼠心肌組織XIAP蛋白表達(dá)從再灌注3小時開始降低(1.00±0.19 vs.同期偽手術(shù)組1.61±0.12，P＜0.05)，再灌注12小時達(dá)到最低值(0.65±0.16 vs.同期偽手術(shù)組1.42±0.24，P＜0.05)，再灌注24小時其表達(dá)有所恢復(fù)，但仍維持在較低水平(0.9

10、4±0.16 vs.同期偽手術(shù)組1.53±0.21，P＜0.05)。⑹成年大鼠心肌缺血/再灌注不同時間點(diǎn)心肌組織中XIAP的mRNA水平檢測用實時定量PCR的方法檢測成年大鼠心肌缺血/再灌注不同時間點(diǎn)心肌組織中XIAP的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明：和同期偽手術(shù)組相比，心肌缺血/再灌注組大鼠心肌組織中XIAP的mRNA水平無明顯改變(P＞0.05)。以上結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注后大鼠心肌組織中XIAP的降低只發(fā)生在蛋白水平，其mRNA水

11、平無改變。⑺成年大鼠心肌缺血/再灌注心肌組織中XIAP蛋白表達(dá)與+dp/dtmax呈正相關(guān)通過對心肌缺血/再灌注心肌組織中XIAP與心肌缺血/再灌注心功能的直線相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)成年大鼠缺血/再灌注心肌組織中XIAP蛋白水平與心肌收縮力指標(biāo)+dp/dtmax呈正相關(guān)(r=0.655，n=42，P＜0.05)(圖14)，提示：XIAP表達(dá)減少可能與心肌缺血/再灌注后心臟收縮功能障礙密切相關(guān)。⑻成年大鼠缺血/再灌注心肌組織中XIAP蛋白表達(dá)與L

12、VDP呈負(fù)相關(guān)通過對心肌缺血/再灌注心肌組織中XIAP與心肌缺血/再灌注心功能的直線相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)成年大鼠缺血/再灌注心肌組織中KIAP蛋白水平與心肌舒張功能指標(biāo)LVDP呈負(fù)相關(guān)(r=-0.528，n=41，P＜0.05)(圖15)，提示：XIAP表達(dá)減少可能與心肌缺血/再灌注后心臟舒張功能障礙密切相關(guān)。⑼XIAP特異性抑制劑Embelin可使大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡增加，并加重在體心功能障礙。⑽用TUNEL方法檢測了缺血/再

13、灌注12小時后心肌細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注12小時心肌組織中有少量陽性染色凋亡細(xì)胞；給予XIAP特異性抑制劑Embelin后，心肌組織中陽性染色的凋亡細(xì)胞顯著增多。經(jīng)計算得出：心肌缺血/再灌注12小時心肌細(xì)胞凋亡率為(16.02±1.73％)，給予XIAP特異性抑制劑Embelin后心肌組織中陽性細(xì)胞凋亡率明顯增加(22.97±1.60％，P＜0.05)以上結(jié)果顯示：給予XIAP特異性抑制劑Embelin可進(jìn)一步增加大

14、鼠心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡。⑾與Vehicle組心功能收縮指標(biāo)(+dp/cltma408.63±89.92Kpa/s；LVSP12.78±1.78 Kpa)相比，給予XIAP特異性抑制劑Embelin使心肌缺血/再灌注12小時后心室收縮功能明顯下降(+dp/dtmax308.13±94.22Kpa/s，P＜0.05；LVSP10.84±1.58 Kpa，P＜0.05)。⑿與Vehicle組心功能舒張指標(biāo)LVDP(0.52±1.10

15、Kpa)相比，給予XIAP特異性抑制劑Embelin后可使心肌缺血/再灌注12小時后LVDP明顯增高(1.64±0.88Kpa，P＜0.05)，即舒張功能明顯下降，但-dp/dtmax兩組間比較并無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。以上結(jié)果提示：給予XIAP特異性抑制劑Embelin可以顯著加重心肌缺血/再灌注12小時后心功能障礙。
　　 結(jié)論：本研究首次發(fā)現(xiàn)，成年大鼠心肌缺血/再灌注后心肌組織中XIAP蛋白表達(dá)的變化與心肌細(xì)胞凋亡水