急性心肌缺血大鼠心肌a輔肌動(dòng)蛋白含量變化及其與心功能的關(guān)系.pdf

1、急性心肌缺血是臨床上常見的心血管急癥,也是造成急性死亡的重要原因,最常見于急性冠脈綜合征。然而隨著溶栓、冠脈搭橋手術(shù)以及冠脈擴(kuò)張手術(shù)等治療措施的應(yīng)用,臨床上發(fā)現(xiàn)缺血心肌恢復(fù)血流供應(yīng)以后,心功能的改善并不能達(dá)到預(yù)期效果,可見心肌在缺血過程中發(fā)生了不可逆的損傷。
　　 目前有證據(jù)表明,缺血心肌中細(xì)胞骨架最早發(fā)生不可逆的損傷,如actin在缺血30 min、vinculin在缺血90 min后就會(huì)明顯減少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也提示,內(nèi)毒

2、素血癥大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)actin、desmin、tubulin等骨架蛋白含量的減少是導(dǎo)致心肌舒縮功能減低的原因之一。由此可見,心肌細(xì)胞骨架蛋白在心肌舒縮功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。
　　 對(duì)于心肌細(xì)胞而言,F-actin既是收縮蛋白也是骨架蛋白,并通過多種肌動(dòng)蛋白連接蛋白將其定位于心肌細(xì)胞膜和心肌細(xì)胞Z帶上,借以執(zhí)行心肌收縮舒張功能。α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)就是其中一種連接蛋白,它將肌動(dòng)蛋白連接成束,傳導(dǎo)肌小節(jié)之間的機(jī)

3、械力,一旦α-actinin出現(xiàn)變化將會(huì)直接影響心肌細(xì)胞的收縮舒張功能。因此本研究觀察了急性心肌缺血與細(xì)胞骨架蛋白α-actinin之間的聯(lián)系,并探索其與心肌細(xì)胞功能障礙的關(guān)系及可能機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分:實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(sham),缺血30 min組(I30min、),缺血60 min組(I60min),缺血60 min再灌注2 h組(IR)。通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)建立急性心肌缺血及再灌注模型

4、,觀察心肌缺血對(duì)心肌收縮和舒張功能的影響,并通過組織學(xué)及免疫組化方法觀察心肌組織形態(tài)改變和α-actinin分布及含量的變化。綜合評(píng)價(jià)急性冠狀動(dòng)脈左前降支缺血對(duì)心肌的損傷作用,探討α-actinin是否因缺血受到破壞,α-actinin的破壞是否是心肌收縮舒張功能下降的原因之一。并同時(shí)用ELISA方法檢查心肌組織磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷脂酶C(PLC)含量的變化,觀察其在心肌缺血過程中與心肌功能改變和α-actinin含量變化之間

5、的關(guān)系。
　　 第二部分:我們急性分離大鼠心肌細(xì)胞,在細(xì)胞水平模擬缺氧條件下初步探討急性心肌缺氧時(shí)α-actinin與F-actin分布、形態(tài)和數(shù)量的改變,并應(yīng)用P13K抑制劑(LY-29400)和PLC抑制劑(U-73122)對(duì)缺氧的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),觀察這兩條激酶途徑是否在心肌缺氧時(shí)對(duì)α-actinin含量及心肌功能產(chǎn)生的影響,從而進(jìn)一步深入探討急性心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞骨架蛋白α—actinin及心功能變化的發(fā)生機(jī)制。

6、　　 結(jié)果:
　　 第一部分
　　 (一)急性冠狀動(dòng)脈左前降支缺血再灌注對(duì)大鼠心功能的影響不同處理組之間左心室收縮壓(LNSP)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.799,P=0.000)；隨冠脈缺血時(shí)間延長(zhǎng),大鼠INSP逐漸下降；再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.001)；從各時(shí)間點(diǎn)看,缺血60 min后LVSP最低。I30mim組、I60min組、IR組分別與sham組相比,LVSP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為

7、0.001、0.000、0.001)。而I30min組、IR組與I60min組相比,LVSP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.033,0.037)。
　　 不同處理組之間左心室舒張末壓(LVEDP)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.965,P=0.000)；隨冠脈缺血時(shí)間延長(zhǎng),大鼠INEDP逐漸升高,再灌注后部分回落,但仍高于sham組(P=0.000)。從各時(shí)間點(diǎn)看,缺血60 min后LVEDP最高。采用LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),I30mi

8、n組、I60min組、IR組分別與sham組相比,LVEDP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)。而I30min組與I60min組相比,LVEDP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。
　　 不同處理組之間左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt max)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.532,P=0.000)；隨冠脈缺血時(shí)間延長(zhǎng),大鼠+dp/dt max逐漸下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.000)。從各時(shí)間點(diǎn)看,缺血

9、60 min后+dp/dtmax最低。I30min組、I60min組、IR組分別與sham組相比,+dp/dt max差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)。
　　 不同處理組之間左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt max)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.995,P=0.000):sham組大鼠-dp/dt max最大,隨缺血冠脈時(shí)間延長(zhǎng),大鼠-dp/dt max逐漸下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham組(P=0.001)。從各時(shí)

10、間點(diǎn)看,缺血60 min后-dp/dt max最低。I30min組、I60min組、IR組分別與sham組相比,-dp/dt max差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.002、0.000、0.001)。
　　 (二)缺血心肌組織病理檢查結(jié)果sham組心肌組織未見明顯病理學(xué)改變,心肌纖維排列整齊,細(xì)胞形態(tài)良好,結(jié)構(gòu)完整,橫紋清晰:I30min組心肌纖維排列變疏松,心肌間質(zhì)有紅細(xì)胞滲出；I60min組部分心肌呈波浪狀改變及心肌纖維嗜酸性

11、改變,肌漿嗜伊紅性減弱,間質(zhì)水腫,橫紋模糊,心肌纖維斷裂,可見游離細(xì)胞核；IR組仍可見心肌纖維斷裂,膜下空泡,肌漿嗜伊紅性同sham組。
　　 (三)心肌組織α-actinin免疫組化檢測(cè)結(jié)果以肌纖維中棕黃色或棕褐色為α-actinin陽(yáng)性表達(dá)。α-actinin主要沿心肌Z線呈條帶狀分布,sham組中α-actinin分布規(guī)則,染色均勻,與橫紋排列一致。隨冠脈缺血時(shí)間延長(zhǎng),I30min組、I60min組α-acinin分布不均

12、,出現(xiàn)點(diǎn)狀甚至大片缺失。IR組α-acinin染色不均,少量缺失,但灰度值高于缺血組。不同處理組之間α-actinin灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.802,P=0.000)。I60min組α-actinin灰度值最低,分別與sham組、I30min組、IR組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、0.024、0.039)。
　　 (四)心肌組織PI3K、PLC含量的檢測(cè)結(jié)果不同處理組之間心肌組織P13K含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義(F=10.976,P=0.000)。sham組中P13K.有少量表達(dá)。隨冠脈缺血時(shí)間的延長(zhǎng),心肌組織PI3K.含量呈逐漸增加趨勢(shì)。I60min組分別與sham組和I30min.組相比,PI3K含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、0.042)。
　　 不同處理組之間心肌組織PLC含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.275,P=0.001)。sham組中PLC有少量表達(dá)。隨冠脈缺血時(shí)間的延長(zhǎng),心肌組織PLC含量呈逐漸增加趨勢(shì),

14、再灌注后有所下降。I60min組分別與sham組和I30min組相比,PLC含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001、0.002)； IR組PLC含量與I60min相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.736)。
　　 第二部分
　　 (一)以培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量判定心肌細(xì)胞損傷程度:
　　 缺氧培養(yǎng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH漏出量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.892,P=0.000)。Control組培養(yǎng)

15、基中LDH含量較低。I60min組、IR組、LY-294002組和U-73122組培養(yǎng)基中LDH含量大大增加,與control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均為0.000)。
　　 (二)心肌細(xì)胞存活率:
　　 不同處理組之間細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.618,P=0.000)。Control組中心肌細(xì)胞存活率最高。I60min組和IR組細(xì)胞存活率下降,LY-294002組和U-73122組細(xì)胞存活率更低。I60m

16、in組、IR組、LY-294002組、U-73122組分別與control組相比細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000),LY-294002組、U-73122組分別與I60min組相比細(xì)胞存活率差差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.016、0.002)。
　　 (三)單個(gè)心肌細(xì)胞收縮舒張功能:
　　 不同處理組之間心肌細(xì)胞收縮幅度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.893,P=0.000)。Control組中心肌細(xì)胞收縮幅度

17、最大。I60min組心肌細(xì)胞收縮幅度最低,較control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。LY-294002組及U-73122組心肌細(xì)胞收縮幅度大大增加,與I60min組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、0.001)；LY-294002組與control組相比心肌細(xì)胞收縮幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.689)。
　　 (四)不同刺激對(duì)心肌細(xì)胞α—actinin熒光強(qiáng)度改變不同處理組之間心肌細(xì)胞α-actini

18、n熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.770,P=0.000)。Control組中心肌細(xì)胞α-actinin熒光強(qiáng)度最高,I60min組心肌細(xì)胞α-actinin熒光強(qiáng)度最低,較control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。應(yīng)用LY-294002及U-73122處理心肌細(xì)胞后α-actinin熒光強(qiáng)度較I60min組明顯升高(P值均為0.000),但仍低于control組(P值為0.000、0.001)。
　　 (五)

19、不同刺激對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量的影響不同處理組之間心肌細(xì)Ca2+-Mg2+-ATPase含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.668,P=0.000)。Control組中心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量最高,I60min組心肌細(xì)胞ca2+-Mg2+-ATPase含量最低,與control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。應(yīng)用LY-294002及U-73122處理心肌細(xì)胞后Ca2+-Mg2+-ATPa

20、se含量較I60min組高(P值均為0.000),但仍低于control組(P值為0.033、0.020)。
　　 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究可以初步得出以下結(jié)論:
　　 1.在整體水平上,冠狀動(dòng)脈缺血60 min可以引起心肌功能障礙和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞。
　　 2.冠狀動(dòng)脈缺血后心肌細(xì)胞骨架蛋白α-actinin的變化可能是缺血引起心功能障礙的原因之一。
　　 3.冠狀動(dòng)脈缺血后α-actinin的改變可能