染色體的易位、重排與B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病關(guān)系的初步研究.pdf

1、對淋巴瘤的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因分析始于上世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)根據(jù)IgVH基因的體細(xì)胞突變(somaticmutation，SM)狀況有助于判斷B細(xì)胞腫瘤的細(xì)胞來源。1999年Hamblin等根據(jù)IgVH基因是否存在SM將慢性淋巴細(xì)胞白血病分為預(yù)后不同的兩類。該研究重新燃起了人們對IgVH基因研究的熱情，此后關(guān)于不同淋巴瘤IgVH基因突變狀況的大樣本研究陸續(xù)展開。IgVH基因作為一種獨(dú)特的免疫球蛋白受體表達(dá)于大多數(shù)的B細(xì)

2、胞淋巴瘤，檢測IgVH基因的突變狀況是追蹤腫瘤發(fā)展階段的一個有用方法。 以往對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的研究表明這類腫瘤絕大多數(shù)含有突變的VH基因，說明該腫瘤曾經(jīng)歷過體細(xì)胞突變。然而在腫瘤細(xì)胞中這種體細(xì)胞突變是否仍在持續(xù)進(jìn)行(即克隆內(nèi)超突變，intraclonalhypermutation)，以及如果存在克隆內(nèi)超突變，該腫瘤細(xì)胞是來自于正常細(xì)胞的某一特定階段抑或是與細(xì)胞本研究獲浙江省自然科學(xué)研究基金(編碼Y205292

3、)和衛(wèi)生廳科學(xué)研究基金(編碼2006A084)資助來源無關(guān)的本身固有特性?為了回答這個問題，我們對34例DLBCL病例進(jìn)行分類，并檢測IgVH基因，以期對DLBCL的分子特征有進(jìn)一步的了解。 自從1972年在Burkitt淋巴瘤中首次發(fā)現(xiàn)染色體t(8；14)易位以來，越來越多的研究證據(jù)表明染色體易位在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。染色體易位與非霍奇金淋巴瘤(NHL)的組織學(xué)亞型、免疫表型和臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。染色體易位導(dǎo)致融

4、合基因的形成，從而編碼具有特定生化性質(zhì)的融合蛋白，改變了該基因的表達(dá)。 染色體t(14；18)(q32；q21)易位是NHL中最常見的染色體易位，見于85％-90％的濾泡性淋巴瘤(FL)，在FL的發(fā)病中起了重要作用。t(14；18)染色體易位的結(jié)果是產(chǎn)生一條衍生型的14號染色體，使BCL-2基因從正常的18q21位置上斷裂下來，與14號染色體免疫球蛋白重鏈基因(IgH)的增強(qiáng)子序列并置，從而導(dǎo)致BCL-2基因激活。有實驗表明轉(zhuǎn)染

5、了BCL-2/IgH的小鼠，在延長細(xì)胞存活時間的基礎(chǔ)上，更表現(xiàn)出發(fā)生淋巴瘤的傾向。 染色體t(14；18)(q32；q21)易位不僅見于85％-90％的FL，在約30％的DLBCL中也出現(xiàn)此易位，其中除由FL轉(zhuǎn)化而來的DLBCL在18％-20％的原發(fā)性DLBCL中可見到此易位。t(14；18)易位在原發(fā)性DLBCL中有何意義，它是否也像在FL中那樣代表了由發(fā)生中心細(xì)胞起源的腫瘤呢? 染色體t(14；18)易位作為FL的分

6、子遺傳學(xué)特征，近年來應(yīng)用高度敏感的PCR在50％-70％的歐美正常人群外周血中亦檢出此易位。該發(fā)現(xiàn)提示歐美正常人群中的這一遺傳背景似乎與歐美人群中FL較亞洲人群高發(fā)有關(guān)。根據(jù)現(xiàn)代對腫瘤發(fā)生“多步打擊學(xué)說”理論的理解，歐美正常人群中的這一遺傳背景可能是FL發(fā)生多步環(huán)節(jié)中較早的一環(huán)。對于亞洲正常人群，包括我國在內(nèi)，BCL-2/IgH易位頻率與相應(yīng)地區(qū)FL低發(fā)生率相關(guān)性的研究較少。 在本實驗中我們對DLBCL中出現(xiàn)BCL-2/IgH易

7、位的意義作了初步的研究。另外我們也初步探討了浙江地區(qū)漢族人群中BCL-2/IgH易位現(xiàn)象，以期獲得中國浙江地區(qū)人群中BCL-2/IgH易位的遺傳特征。 一.實驗材料 (1)正常人血標(biāo)本：收集浙江地區(qū)漢族196名健康體檢者(男性94名，女性102名)的外周血。 (2)淋巴瘤標(biāo)本：收集1997-2004年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院34例原發(fā)性DLBCL標(biāo)本。全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色。根據(jù)20

8、01年WHO關(guān)于淋巴及造血組織腫瘤分類對所有病例進(jìn)行分類。 二.方法步驟 (1)DNA抽提：外周血標(biāo)本應(yīng)用鹽析法獲得單核細(xì)胞DNA；淋巴瘤石蠟標(biāo)本應(yīng)用經(jīng)典蛋白酶K-酚氯仿法抽提腫瘤組織的DNA。 (2)應(yīng)用抗體CD10，BCL6,MUM1在腫瘤組織中行免疫組化檢測，根據(jù)抗體的表達(dá)情況將DLBCL病例分為發(fā)生中心(GC)亞型與非發(fā)生中心(non-GC)亞型。用抗體BCL-2在腫瘤組織中行免疫細(xì)化檢測。 (3

9、)IgVH基因檢測：采用半巢式PCR，對所有DLBCL病例應(yīng)用FR2A引物檢測IgVH基因重排，分析體細(xì)胞突變狀況。在5例發(fā)生中心亞型的病例及5例隨機(jī)抽取的非發(fā)生中心亞型病例中對IgVH基因進(jìn)行TA克隆，分析克隆內(nèi)超突變狀況。 (4)BCL-2/IgH易位基因檢測：對DLBCL病例應(yīng)用單對引物PCR擴(kuò)增易位片段。對外周血標(biāo)本應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增易位片段，并將PCR產(chǎn)物直接測序。 (5)統(tǒng)計：采用SPSS11.5軟件，x2檢

10、驗，F(xiàn)isher's精確概率法以及Spearman's相關(guān)性分析方法。 三.結(jié)果 (1)本組34例DLBCL病例中8例屬于GC亞型，26例病例認(rèn)為是非GC亞型的。 (2)本組34例DLBCL病例中應(yīng)用FR2A引物檢測IgH重排，22例可見陽性條帶。其中8例GC亞型DLBCL病例中5例出現(xiàn)陽性條帶。 (3)本組22例DLBCL重排陽性病例中出現(xiàn)23個VH基因片段，分別來自7個人類VH基因家族中的4個，其中V

11、H3使用頻率最高。VH片段與相應(yīng)胚系基因相比較突變頻率為0-18.60％，平均為7.72％。 (4)對全部5例重排陽性的GC亞型DLBCL病例和5例隨機(jī)選擇的非GC亞型DLBCL病例進(jìn)行克隆內(nèi)超突變分析顯示，在5例GC亞型病例中4例出現(xiàn)克隆內(nèi)超突變，而在5例非GC亞型的DLBCL病例中均未出現(xiàn)克隆內(nèi)超突變。兩組之間存在明顯差異。 (5)本組34例DLBCL病例中有4例存在BCL-2/IgH易位，陽性率為11.8％。其中3

12、例出現(xiàn)在GC亞型病例中，1例出現(xiàn)在非GC亞型病例中。在4例BCL-2/IgH易位病例中，2例存在BCL-2蛋白表達(dá)，2例無BCL-2蛋白表達(dá)。 (6)本樣本人群中BCL-2/IgH易位率為9.66％，低于歐美人群。 (7)正常人群中BCL-2/IgH易位在MBR區(qū)的斷裂位點(diǎn)主要集中于bp3055,3115,3165三個位點(diǎn)附近，6個JH片段使用率以JH6片段為最高。 (8)BCL-2/IgH易位可能存在雙克隆起源