microRNa-106a與淋巴瘤發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的:惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是原發(fā)于淋巴結(jié)和（或）結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，為兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤之一，目前淋巴瘤發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，故給臨床診斷及治療帶來困惑，對兒童健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此尋求病因、早期發(fā)現(xiàn)、治療中動態(tài)觀察、均需要一種特異性高且檢測方法簡單便捷的標(biāo)志物作為臨床指標(biāo)，這對提高兒童淋巴瘤治愈率、生存率具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-106a與人體的生長發(fā)育、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切

2、，miR-106a已被證實(shí)在人類多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，因此被認(rèn)為是一種致癌的miRNA，miR-106a在惡性淋巴瘤中的表達(dá)情況報(bào)道較少，且在淋巴瘤細(xì)胞調(diào)控中是如何發(fā)揮作用的尚未見報(bào)道。pRb/E2F1細(xì)胞調(diào)控通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，通路中有Rb1（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因）、E2F1（轉(zhuǎn)錄因子），最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA也出現(xiàn)在該通路中，該通路中當(dāng)Rb1合成減少，E2F1的活動不受監(jiān)控，將引起細(xì)胞周期紊亂和無限制的增殖，使Caspase-3激

3、活減少，腫瘤細(xì)胞增生。Rb1是一種抑癌基因，是miR-106a下游的靶基因之一，miR-106a通過與Rb1mRNA相結(jié)合而抑制Rb1mRNA的翻譯，導(dǎo)致Rb1蛋白的生成減少，使細(xì)胞增殖得不到控制。E2F1是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，它的表達(dá)依賴于Rb1，是細(xì)胞周期期向G1向S期過渡的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用。Caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心因子，是大多數(shù)細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因素，最終都是通過Ca

4、spase-3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮凋亡作用的。
　　 阿霉素是一種廣譜抗腫瘤抗生素，它的主要作用機(jī)制是直接嵌入DNA核酸堿基對之間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA的形成等起到抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞為研究對象，檢測miRNA-106a表達(dá)，探討用阿霉素干預(yù)后細(xì)胞通路中Rb1、E2F1、Caspase-3J及miRNA-106a的變化情況探索淋巴瘤發(fā)病機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)人T細(xì)胞淋巴瘤Jurk

5、at細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)1組，用不同濃度的阿霉素干預(yù)Jurkat細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)2組，同時(shí)設(shè)20例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞為對照組，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time PCR)檢測各組細(xì)胞的miR-106a及用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測Rb1、E2F1、Caspase-3在上述各組中的表達(dá)情況，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度阿霉素干預(yù)Jurkat細(xì)胞后的生長情況;

6、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析阿霉素干預(yù)Jurkat細(xì)胞后的周期變化，并檢測細(xì)胞凋亡情況;了解阿霉素對上述因子的影響。采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05具有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)2組不同濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞24，48，72h后，與實(shí)驗(yàn)1組相比，吸光度值(OD)均有不同程度的下降。除各濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞24小時(shí)后的吸光度值與與實(shí)驗(yàn)1組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

7、（P＞0.05），各濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞48、72h后的吸光度值與實(shí)驗(yàn)1組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05），且不同濃度之間、不同時(shí)間之間吸光度值也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 2、Real Time PCR檢測結(jié)果顯示:在實(shí)驗(yàn)1組中，miR-106a表達(dá)水平明顯高于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)2組不同濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞48，72h后，miR-106a的相對表達(dá)量均低于實(shí)驗(yàn)

8、1組，并隨作用濃度的升高、時(shí)間的延長相對表達(dá)量降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、RT-PCR檢測結(jié)果顯示:在實(shí)驗(yàn)1組中，Rb1、Caspase-3的表達(dá)水平明顯低于對照組，同時(shí)E2F1的表達(dá)水平明顯高于對照組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)2組不同濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞48，72h后，Rb1、Capase-3的相對表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)1組，隨作用濃度的升高、時(shí)間的延長相對表達(dá)量增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.05)，同時(shí)E2F1的相對表達(dá)量均低于實(shí)驗(yàn)1組，并隨作用濃度的升高、時(shí)間延長相對表達(dá)量減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)2組不同濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞48，72h后，細(xì)胞周期分布均發(fā)生明顯變化，G1/S期細(xì)胞數(shù)增多，G0期、G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，G1/S期細(xì)胞數(shù)與實(shí)驗(yàn)1組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);同時(shí)均出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而實(shí)驗(yàn)1組未見凋亡峰，且各濃度

10、組48h、72h的細(xì)胞凋亡率與實(shí)驗(yàn)1組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 5、不同的阿霉素處理Jurkat細(xì)胞后miR-106a與上述3因子變化的相關(guān)性:實(shí)驗(yàn)2組不同濃度的阿霉素作用于Jurkat細(xì)胞48，72h后，miR-106a與Rb1、Caspase-3均呈負(fù)相關(guān)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.01)。與E2F1呈正相關(guān)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、用

11、不同濃度阿霉素干預(yù)Jurkat細(xì)胞后miR-106a、E2F1表達(dá)水平降低，同時(shí)Rb1、Caspase-3表達(dá)水平明顯升高， G1/S期細(xì)胞數(shù)增多，G2/M、G0期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡率上升，認(rèn)為細(xì)胞阻滯于G1/S期可能與E2F1表達(dá)抑制有關(guān)，促使了Jurkat細(xì)胞凋亡。說明阿霉素對miR-106a的表達(dá)有一定抑制作用。
　　 2、miR-106a與Rb1、Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與E2F1表達(dá)呈正相關(guān);同時(shí)Rb1表

12、達(dá)與E2F1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Caspase-3表達(dá)呈正相關(guān);E2F1表達(dá)與Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明miR-106a與pRb/E2F1細(xì)胞調(diào)控通路具有相關(guān)性，阿霉素可減少miR-106a使通路發(fā)生變化，從而抑制Jurkat細(xì)胞的增殖。
　　 3、在淋巴瘤細(xì)胞Jurkat細(xì)胞中miR-106a、E2F1表達(dá)水平與對照組相比明顯升高，Rb1、Caspase-3表達(dá)水平明顯降低，說明miR-106a與靶基因Rb1作用后Rb1

13、表達(dá)減少，Jurkat細(xì)胞凋亡減少。認(rèn)為miR-106-a可能通過下調(diào)Rb1的表達(dá)，使其不能抑制E2F1誘導(dǎo)的增殖，Caspase-3激活減少，從而引起腫瘤增殖的發(fā)生，這可能是miR-106a作為癌基因通過pRb/E2F1細(xì)胞調(diào)控通路發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。
　　 4、miR-106a在淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中表達(dá)較正常人高，用不同濃度阿霉素干預(yù)后miR-106a有下降，miR-106a有可能做為淋巴瘤診斷、治療療效觀察的標(biāo)記物