羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)特異性分子機制.pdf

1、生物的性別、生殖現(xiàn)象是生物學研究的主要內容之一，它涉及到許多重大的生物學問題，比如性別決定、遺傳、發(fā)育和進化等，因此歷來倍受關注。 目前對于性別、生殖的分子機制研究主要集中在人類和模式生物中，而對于一般水生生物這方面的研究很少，尤其在甲殼類中，已知的相關分子信息更加缺乏。蝦類作為具有重要經濟價值的水生生物，在分子水平的研究開展得相對較少，因此，大量獲取水生動物性別和生殖相關基因資源來研究它們的生殖生物學、遺傳育種等顯得尤為必要。

2、 本論文以羅氏沼蝦為研究對象，開展關于性別與生殖相關分子機制的研究。在甲殼動物中首次采用大規(guī)模篩選差異基因的方法，即抑制性消減雜交，利用該方法建立了富含雄性特異性基因的消減文庫。通過篩選差異性文庫并測序，在Genbank通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)一個克隆包含兩個保守的Kazal型domain，命名為MRPINK，另外三個序列是新的表達序列，其中之一包含有開放閱讀框(ORF)，命名為Mar-Mrr。 在此基礎上應用5'-RA

3、CE和3'-RACE的方法，直接體外擴增，從而獲得基因全長cDNA。Mar-MrrcDNA全長為683bp，編碼區(qū)333bp，編碼110個氨基酸，分子量約11.7kDa。Mar-Mrr基因5'和3'非翻譯區(qū)長度分別是82bp和268bp，其中3'非翻譯區(qū)具有兩個多聚腺苷酸信號，分別位于poly(A)上游64bp和14bp；推演的多肽含有24個氨基酸的信號肽和86個氨基酸的成熟肽，其中Gly、Ser和Ala含量較高，分別為15.4％、10

4、.9％和9.1％。MRPINKcDNA全長為736bp，編碼區(qū)405bp，編碼135個氨基酸，分子量約14.7kDa的多肽分子，MRPINK基因5'和3'非翻譯區(qū)長度分別是72bp和247bp，其中3'非翻譯區(qū)具有一個多聚腺苷酸信號；推演的氨基酸序列中含有兩個Kazal型domain，且包含21個氨基酸的信號肽。 Mar-Mrr與Genbank已知序列無同源性、相似性，在羅氏沼蝦中屬于首次克隆到的雄性生殖相關功能基因。MRPIN

5、K和已知的Kazal型蛋白酶抑制劑在氨基酸序列上的同源性為16-32％，其Kazal型domain序列上有19-52％的同源性，表明這個蛋白屬于Kazal家族中的成員，在無脊椎動物中，這是首次獲得與性別生殖相關的Kazal型蛋白酶抑制劑的基因信息。此外含有兩個Kazal型結構域并且與生殖相關的蛋白酶抑制劑基因在包括脊椎動物中也是首次報道。 利用Northernblotting和半定量RT-PCR等分子生物學手段進行表達分析，結果

6、表明Mar-Mrr和MRPINK基因均只在雄性生殖系統(tǒng)特異性表達，并且在輸精管中的表達較高。于是進一步追蹤研究這兩個基因隨著不同生長發(fā)育時期mRNA的轉錄變化模式。Mar-MrrmRNA隨著雄性生殖系統(tǒng)的成熟，表達有所增加。此外就Mar-Mrr研究了它隨著促雄性腺的生長成熟基因表達的變化，結果表明Mar-Mrr在雄性生殖系統(tǒng)中的表達隨著促雄性腺的成熟呈現(xiàn)增加趨勢，暗示著這一基因的表達可能具有激素效應調控機制。研究表明MRPINK在雄性生

7、殖系統(tǒng)成形后，基因轉錄水平基本維持恒定。 為了進一步分析這兩種分子在雄性生殖系統(tǒng)中的組織定位，我們使用了Insituhybridization，結果證明這兩個基因特異性的表達于輸精管內壁分泌型細胞中。結合Mar-Mrr的表達特征，我們推測Mar-Mrr的表達可能與精子成熟和精莢形成有關，而MRPINK的表達恒定性與它的定位則暗示著它可能在維持精子內環(huán)境和雄性生殖系統(tǒng)可塑性等方面發(fā)揮功能?；蚪M研究表明這兩個基因均沒有內含子，So

8、uthernblotting結果說明這兩個基因均為多拷貝基因。通過PCR和Southernblotting證明Mar-Mrr在雄性與雌性基因組上無差別，說明Mar-Mrr不是性染色體特異性基因。由于Mar-Mrr與已知基因和蛋白序列沒有任何相似性，因此基于目前對于性別和生殖相關基因研究的認識，Mar-Mrr可能具有種屬特異性。 總之，該研究首次在甲殼類生物中發(fā)現(xiàn)雄性特異性的與生殖和發(fā)育相關的功能基因Mar-Mrr，并且首次在無脊