羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)特異性分子機(jī)制.pdf

1、生物的性別、生殖現(xiàn)象是生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，它涉及到許多重大的生物學(xué)問題，比如性別決定、遺傳、發(fā)育和進(jìn)化等，因此歷來倍受關(guān)注。 目前對(duì)于性別、生殖的分子機(jī)制研究主要集中在人類和模式生物中，而對(duì)于一般水生生物這方面的研究很少，尤其在甲殼類中，已知的相關(guān)分子信息更加缺乏。蝦類作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水生生物，在分子水平的研究開展得相對(duì)較少，因此，大量獲取水生動(dòng)物性別和生殖相關(guān)基因資源來研究它們的生殖生物學(xué)、遺傳育種等顯得尤為必要。

2、 本論文以羅氏沼蝦為研究對(duì)象，開展關(guān)于性別與生殖相關(guān)分子機(jī)制的研究。在甲殼動(dòng)物中首次采用大規(guī)模篩選差異基因的方法，即抑制性消減雜交，利用該方法建立了富含雄性特異性基因的消減文庫。通過篩選差異性文庫并測序，在Genbank通過BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆包含兩個(gè)保守的Kazal型domain，命名為MRPINK，另外三個(gè)序列是新的表達(dá)序列，其中之一包含有開放閱讀框(ORF)，命名為Mar-Mrr。 在此基礎(chǔ)上應(yīng)用5'-RA

3、CE和3'-RACE的方法，直接體外擴(kuò)增，從而獲得基因全長cDNA。Mar-MrrcDNA全長為683bp，編碼區(qū)333bp，編碼110個(gè)氨基酸，分子量約11.7kDa。Mar-Mrr基因5'和3'非翻譯區(qū)長度分別是82bp和268bp，其中3'非翻譯區(qū)具有兩個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)，分別位于poly(A)上游64bp和14bp；推演的多肽含有24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和86個(gè)氨基酸的成熟肽，其中Gly、Ser和Ala含量較高，分別為15.4％、10

4、.9％和9.1％。MRPINKcDNA全長為736bp，編碼區(qū)405bp，編碼135個(gè)氨基酸，分子量約14.7kDa的多肽分子，MRPINK基因5'和3'非翻譯區(qū)長度分別是72bp和247bp，其中3'非翻譯區(qū)具有一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)；推演的氨基酸序列中含有兩個(gè)Kazal型domain，且包含21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。 Mar-Mrr與Genbank已知序列無同源性、相似性，在羅氏沼蝦中屬于首次克隆到的雄性生殖相關(guān)功能基因。MRPIN

5、K和已知的Kazal型蛋白酶抑制劑在氨基酸序列上的同源性為16-32％，其Kazal型domain序列上有19-52％的同源性，表明這個(gè)蛋白屬于Kazal家族中的成員，在無脊椎動(dòng)物中，這是首次獲得與性別生殖相關(guān)的Kazal型蛋白酶抑制劑的基因信息。此外含有兩個(gè)Kazal型結(jié)構(gòu)域并且與生殖相關(guān)的蛋白酶抑制劑基因在包括脊椎動(dòng)物中也是首次報(bào)道。 利用Northernblotting和半定量RT-PCR等分子生物學(xué)手段進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果

6、表明Mar-Mrr和MRPINK基因均只在雄性生殖系統(tǒng)特異性表達(dá)，并且在輸精管中的表達(dá)較高。于是進(jìn)一步追蹤研究這兩個(gè)基因隨著不同生長發(fā)育時(shí)期mRNA的轉(zhuǎn)錄變化模式。Mar-MrrmRNA隨著雄性生殖系統(tǒng)的成熟，表達(dá)有所增加。此外就Mar-Mrr研究了它隨著促雄性腺的生長成熟基因表達(dá)的變化，結(jié)果表明Mar-Mrr在雄性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)隨著促雄性腺的成熟呈現(xiàn)增加趨勢，暗示著這一基因的表達(dá)可能具有激素效應(yīng)調(diào)控機(jī)制。研究表明MRPINK在雄性生

7、殖系統(tǒng)成形后，基因轉(zhuǎn)錄水平基本維持恒定。 為了進(jìn)一步分析這兩種分子在雄性生殖系統(tǒng)中的組織定位，我們使用了Insituhybridization，結(jié)果證明這兩個(gè)基因特異性的表達(dá)于輸精管內(nèi)壁分泌型細(xì)胞中。結(jié)合Mar-Mrr的表達(dá)特征，我們推測Mar-Mrr的表達(dá)可能與精子成熟和精莢形成有關(guān)，而MRPINK的表達(dá)恒定性與它的定位則暗示著它可能在維持精子內(nèi)環(huán)境和雄性生殖系統(tǒng)可塑性等方面發(fā)揮功能。基因組研究表明這兩個(gè)基因均沒有內(nèi)含子，So

8、uthernblotting結(jié)果說明這兩個(gè)基因均為多拷貝基因。通過PCR和Southernblotting證明Mar-Mrr在雄性與雌性基因組上無差別，說明Mar-Mrr不是性染色體特異性基因。由于Mar-Mrr與已知基因和蛋白序列沒有任何相似性，因此基于目前對(duì)于性別和生殖相關(guān)基因研究的認(rèn)識(shí)，Mar-Mrr可能具有種屬特異性。 總之，該研究首次在甲殼類生物中發(fā)現(xiàn)雄性特異性的與生殖和發(fā)育相關(guān)的功能基因Mar-Mrr，并且首次在無脊